杂交分析基因的表达

杂交分析基因的表达_植物发育生物学实

实验十九　Northern杂交分析基因的表达

【实验目的】

1.了解Northern杂交的原理。

2.掌握Northern杂交的技术和步骤。

【实验原理】

继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出了一种类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自建立以来已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。

与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物(如尼龙膜、硝酸纤维素膜等)上，再用放射性或非放射性标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影(或化学显影)，以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量(即目标RNA的丰度)。但与Southern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳;此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达水平的情况。

Northern杂交用于确定RNA或poly(A) RNA样品中某一特定RNA的大小和丰度，分析目的基因在植株和组织中的表达情况。

【实验材料】

拟南芥和烟草野生型植株及转基因植株。

【实验器材】

高速离心机，电泳仪，核酸凝胶电泳槽，紫外凝胶成像系统，FX分子成像系统等。

【药品试剂】

1.0.5mol/L EDTA: 16.61g EDTA加ddH₂ O至80ml，调pH值至8，定容至100ml。

2.50mmol/L醋酸钠: 3.4g醋酸钠，加ddH₂ O至500m l，加0.5ml DEPC，37℃振荡过夜，高压灭菌。

3.5×甲醛凝胶电泳缓冲液: 10.3g MOPS(3-(N-玛琳代)丙磺酸)加400ml 50mmol/L醋酸钠，用2mol/L NaOH调pH值至7.0，再加入10ml 0.5mol/L EDTA，加DEPC H₂ O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。

4.20×SSC: 175.3g NaCl、88.2g柠檬酸三钠，加ddH₂ O至800ml，用2mol/L NaOH调pH值至7，再用ddH₂O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。

5.6×SSC: 20×SSC 300m l中加入ddH₂ O至1000m l。DEPC处理，高压灭菌。

6.50×Denhardt: 0.5g聚蔗糖，0.5g聚乙烯吡咯烷酮，0.5g牛血清白蛋白(BSA)，加ddH₂O至50ml，无菌抽滤后分装。

7.1mol/L Na₂ HPO₄: 35.81g Na₂ HPO₄·12H₂ O，加dd H₂ O至100ml。

8.1mol/L NaH₂ PO₄: 15.6g NaH₂ PO₄·2H₂ O，加dd H₂ O至100ml。

9.0.1mol/L磷酸钠缓冲液( pH 6.6): 35.2ml 1mol/L Na₂ HPO₄和64.8ml 1mol/L NaH₂ PO₄，混匀后定容到1 L。

10.STE缓冲液: 2.5ml 1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5ml 0.5mol/L EDTA，5ml 5mol/L NaCl，加dd H₂O至250ml。

11.预杂交液: 5ml 20×SSC，10ml甲酰胺，4ml 50×Denhardt，0.2ml 1mol/L磷酸钠缓冲液pH6.6，1ml 10% SDS，总体积20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA(10mg/ml)，使终浓度为4μl/ ml。

12.DEPC-H₂O: 1000ml dd H₂ O中加入1ml DEPC，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。

13.6倍RNA上样缓冲液(购买商品化试剂)。

【实验方法】

一、RNA的提取

1.液氮研磨植物组织，将研磨好的样品加入1ml RNA提取试剂，室温下放置5分钟。

2.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒。

3.室温放置2～3分钟，12000r/min，4℃，离心15分钟。

4.上清液转移到另一离心管中，加入0.5ml异丙醇室温沉淀RNA 10分钟。

5.12000r/min，4℃，离心10分钟。

6.用70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥。

7.沉淀溶于DEPC-H₂O。

目前在实验中多采用TRIzol试剂提取RNA，可采用下列步骤提取RNA。

1.100mg植物组织在液氮中研磨充分。

2.加入600μl TRIzol试剂，反复颠倒混匀。

3.将离心管置于冰上，当所有的样品都研磨之后，在每个离心管中加入400μl TRIzol试剂，并混匀。

4.上述混合物在室温放置5分钟。

5.加入0.2m l氯仿，振荡混匀15秒。

6.将离心管在室温放置2～3分钟，4℃，12000r/min条件下离心15分钟。

7.将上层溶液转移到新的离心管中，加入250μl异丙醇和250μl高盐沉淀试剂(0.8mol/L醋酸钠、1.2mol/L NaCl)混合均匀后室温放置10分钟进行沉淀。

8.移走上清液，并用70%乙醇清洗RNA沉淀一次。

9.室温干燥或者真空干燥RNA沉淀;然后，将RNA沉淀溶解在无RNase的水中，并保存在－70℃。

二、变性胶的制备

取0.2g琼脂糖，加入12.4ml DEPC-H₂ O，加热熔化，于保温状态下加入4ml 5×甲醛凝胶电泳缓冲液、3.6ml 37%甲醛，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5分钟。

三、样品制备

取5μl总RNA(20～30μg)，加入1μl EB(1μg/μl)和1μl 6倍上样缓冲液，65℃温育15分钟、冰浴5分钟。

四、电泳

1.上样。

2.50V电泳，电泳时间约2小时。

3.电泳结束后将胶块置紫外灯下观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置(离加样孔的距离)。

五、将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜

1.按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡1小时。剪去膜一角以便标记样品方位。

2.将胶块切去一角(标记样品方位)，并在20×SSC浸泡2次，每次15分钟。

3.用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman 3 MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。

4.将凝胶翻转后置于平台上湿润的3 MM滤纸中央，3 MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。

5.用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。

6.在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。

7.将两张已湿润的、与凝胶大小相同的3 MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。

8.将一叠(5～8cm厚)略小于3 MM滤纸的纸巾置于3 MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500g的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。

9.使上述RNA转移持续进行15小时左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3 MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5分钟，以去除膜上残留的凝胶。将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。

六、烤膜(交联)

1.将膜置于80℃，真空干烤1～2小时。该步骤也可以在交联仪上进行。

2.烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。

七、探针标记(Prime-a-Gene Labeling System，Promega公司)

1.取模板DNA 25 ng于0.5ml离心管中，95～100℃变性5分钟，冰浴5分钟。

2.dNTP混合物的制备:取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。

3.将下列反应成分按照表2-4所示混合，加入上述微量离心管中。

表2-4　Northern杂交中探针标记的反应体系

加入适量dd H₂O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1小时。

八、预杂交

将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3小时。

九、杂交

1.探针变性: 95～100℃变性5分钟，冰浴5分钟。

2.将变性后的探针加入到预杂交液中，42℃杂交16小时。

十、洗膜

1.倾去杂交液。

2.2×SSC/0.1% SDS室温洗15分钟。

3.0.2×SSC/0.1% SDS，55℃洗2次，每次15分钟。

十一、压片(该步骤目前可以使用磷屏成像系统直接获得实验结果)

1.将膜用dd H₂O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水分。用薄型塑料纸将膜包好置于暗盒中，在暗室中压上X光片。

2.暗盒置－70℃放射自显影3～7天。

【注意事项】

1.操作时必须仔细小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。

2.必要时可采用Sephades G-50柱层析法纯化标记的探针，以去除标记反应中未结合的(游离的)核苷酸。

3.膜的重复使用:结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其他探针杂交。方法如下:杂交的膜(杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合)置于100℃，0.5% SDS中煮沸3分钟，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2～3遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水分。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。

【思考题】

1.Northern杂交的原理和基本操作步骤。

2.Northern杂交中应注意哪些事项。