微生物基因克隆载体

克隆载体（cloning vector）是一类能通过重组DNA技术将有用的目的DNA片段，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的运载工具（vector）。作为克隆载体的基本要求是：① 能进行独立自主复制；② 具有便于外源DNA的插入和限制酶作用的单一切割位点；③ 必须具有可供选择的遗传标记，例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体，λ噬菌体载体，柯斯质粒载体， M13噬菌体载体，真核细胞的克隆载体以及人工染色体等。

1.质粒克隆载体

（1）质粒载体

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，经人工修饰改造后作为克隆载体具有十分有利的特性：① 具有独立复制起点；② 具有较小的相对分子质量，一般不超过15kb；③ 具有较高拷贝数，使外源DNA得以大量扩增；④ 易于导入细胞；⑤ 具有便于选择的标记和具有安全性。

大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中最常用的代表性质粒，是环状双链DNA分子，由4361bp组成，是由博利瓦（Bolivar）等人于1977年构建的一个典型人工质粒载体（图7-3）。可插入大小5kb左右的外源DNA。它具有一个复制起点，是松弛型质粒。当加入氯霉素扩增之后，每个细胞可含有1000～3000个拷贝。pBR322质粒具有2种抗性基因，一个是四环素抗性基因（Tetr），另一个是氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。已知有24种主要限制酶在pBR322分子上均有一个限制性酶切位点。外源DNA片段插入这些位点之中的任一位点时，将导致相应抗性基因的失活。因外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（insertional inactivation）（图7-4）。插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体。

图7-3 pBR322物理图谱（引自The National Health Museum，1999）

（2）其他质粒载体

现已构建了许多新的含有一个人工构建的多克隆位点（multiple cloning sites）的质粒，如p UC系列和pGEM系列的质粒载体。在这些质粒载体上带有不同限制酶单一识别位点的短DNA片段，外源基因可随意插入任何一个位点。同时又由于多克隆位点位于一个基因的编码区内，因此基因的插入、失活极易被检测到。除大肠杆菌质粒外，枯草芽孢杆菌（Bacillus sub-tilis）质粒和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的2μm质粒常作为酵母细胞外源基因的克隆或表达载体。此外，还先后构建了一系列不同类型的穿梭质粒载体（shuttle plasmid vec-tors）。这是一类同时含有两种细胞的复制起点（特别是同时含有原核生物与真核生物的复制起点），能在两种生物细胞中进行复制的质粒载体。其中最常见和被广泛应用的是大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，这种质粒同时含有大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点，故既可在大肠杆菌细胞中复制又可在酵母细胞中进行复制。

图7-4 将DNA插入质粒载体中（引自The National Health Museum，1999）

（3）质粒DNA的制备

从细胞中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，SDS和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶破坏菌体细胞壁和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA可缠绕附着于细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等作用而被切断成大小不同的线性片段。当用高热或强酸、碱处理时，细菌的线形染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA ，简称cccDNA）的二条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

2.λ噬菌体克隆载体

λ噬菌体克隆载体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：① 其分子遗传学背景十分清楚；② 载体容量较大，一般质粒载体只能容纳10多个kb，而λ噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段；③ 具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100％ ，而质粒DNA的转化率却只有0.1％ 。

但由于野生型λ噬菌体DNA的分子很大，基因结构复杂，限制酶有很多切点，且这些切点多数位于必需基因之中，因而不适于作为克隆载体，必须经一系列改造才能用作克隆载体。

构建λ噬菌体克隆载体的基本原则是：① 删除基因组中非必需区，使基因组变小，有利于克隆较大的DNA片段；② 除去多余的限制位点。现已构建了各种各样的λ载体。这些载体可分为两类：一类称为插入型载体（insert vector），其限制酶位点可用于外源DNA的插入；另一类称为取代型载体（replacement vector），具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。重组DNA与包装蛋白混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌体颗粒。

虽然λ噬菌体载体是一类极为有用的克隆载体，但是由于λ噬菌体头部组装时容纳DNA的量是固定的，因此插入外源DNA长度必须控制在使重组DNA为野生型λDNA长度的78％ ～105％之间，否则难以正常组装。

3.柯斯质粒载体

柯斯质粒载体（cosmid vector）即黏粒载体，是由λ噬菌体的黏性末端和质粒构建而成。cosmid一词的意思是带有cos位点的质粒。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自λ噬菌体黏性末端的DNA片段，即cos位点，其对于将DNA包装成λ噬菌体粒子是必需的。

柯斯质粒载体的优点：① 具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在；② 具有质粒DNA的复制方式，重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制；③ 具有克隆大片段外源DNA的能力，柯斯质粒本身一般只有5～7kb左右，而它可克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及λ噬菌体载体的克隆能力。这是其最大优点。

4.M13噬菌体载体

M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp。感染雄性（F＋或Hfr）大肠杆菌并进入细胞后转变成复制型（RF）dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）释放至胞外。

野生型M13不适于直接作为克隆载体，因此人们对其进行改造，构建了一系列M13克隆载体。在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因而野生型M13的改造主要在IG区中进行。M13主要用于制备单链DNA和基因测序。

5.噬菌体质粒载体

噬菌体质粒（phagemid或plasmid）是由丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者的优点，这类载体具有来自M13或f1噬菌体的基因间隔区（内含M13或f1噬菌体复制起点）和来自质粒的复制起点、抗药性标记、一个多克隆位点区等。例如pUC118噬菌体质粒载体就是将野生型M13的基因间隔区插入质粒载体pUC18构建而成的。

噬菌体质粒在宿主细胞内以质粒形式存在，复制产生dsDNA。当用辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，噬菌体质粒的复制就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA并被包装成噬菌体粒子，以出芽方式释放至胞外。

噬菌体质粒载体在应用上具有许多优点：① 载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作；② 克隆外源DNA容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段；③ 可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。

上述几类大肠杆菌克隆载体的克隆能力及其主要用途比较见表7-2。

表7-2 几类大肠杆菌克隆载体比较

6.真核生物的克隆载体

真核生物载体，主要有以下几大类：

（1）酵母质粒载体

酵母质粒载体都是利用酵母的2μm质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，所以又称为穿梭载体。主要有以下三种：

1）附加体质粒（epislmal plasmid）。该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。此外还有来自酵母2μm质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制。当重组质粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。

2）复制质粒（replicating plasmid）。该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr），来自酵母染色体的自主复制序列（ARS），V区以及作为酵母重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。

3）整合质粒（integrating plasmid）。该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr），以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合至酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。

（2）真核生物病毒载体

1）哺乳动物病毒载体。这类病毒载体具有许多突出优点。例如，动物病毒能够有效识别宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中，以及高拷贝和强启动子等，有利于真核外源基因的克隆与表达。许多哺乳动物病毒如SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物可作为基因载体。

2）昆虫病毒载体。昆虫杆状病毒的衍生物作为载体具有的优点主要有高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高达100kb；具有高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的25％ 左右，甚至更多；此外，它具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和哺乳动物疾病。

3）植物病毒载体。一些RNA病毒和DNA病毒已被改造为植物基因工程载体。目前植物基因工程操作较多使用双链DNA病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。

7.人工染色体

酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。酵母染色体的控制系统主要包括三部分：① 着丝粒（centromere，CEN），它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞；② 端粒（telomere，TEL），位于染色体两个末端，功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失；③ 酵母自主复制序列（autonomously replicating sequence，ARS），其功能与酵母细胞复制有关。

YAC克隆外源DNA能力非常大，一个YAC可插入长达106碱基以上DNA片段。因此YAC既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克隆的数目。目前YAC已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。除酵母人工染色体外，现已构建的细菌人工染色体（BAC）更便于基因工程操作，在人类基因组研究中正被广泛应用。