微生物作为克隆载体的宿主

为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，选择合适的克隆载体宿主就成为基因工程的重要问题之一。

1.作为宿主的基本要求与特性

一个理想宿主的基本要求是：① 能够高效吸收外源DNA；② 具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；③ 不具有限制修饰系统，不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；④ 一般为重组缺陷型（RecA－）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；⑤ 便于进行基因操作和筛选；⑥ 具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。

原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于它们具有一些突出优点如生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚，因此已成为当前基因工程被广泛应用的重要克隆载体宿主。各种宿主都有着各自的优点与缺点。

2.外源DNA导入宿主细胞

将外源DNA导入宿主细胞是分子克隆的关键步骤之一。其导入方式是多种多样的：

（1）外源DNA导入原核微生物细胞

外源DNA通过转化、转染以及感染等方式被导入原核生物细胞。

1）转化或转染。如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化或转染方式导入原核细胞。无论转化或转染都需用CaCl2处理宿主细胞，使其变成易于吸收外源DNA的感受态细胞。大肠杆菌转化程序一般为：先用一定浓度冰冷的CaCl2溶液处理指数期的大肠杆菌细胞，然后加入外源DNA并短暂给予42℃热休克处理约90s，使感受态细胞有效吸收外源DNA。一般转化效率可达到每克DNA转化107～108个细胞。

2）λ噬菌体的体外包装与感染。如果外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。体外包装是将重组DNA分子与λ噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整且具有感染力的噬菌体粒子。体外包装的λ噬菌体用以感染宿主细胞，每克DNA可产生109的噬菌斑。而如果仅用重组λDNA分子通过转染进入大肠杆菌的感受态细胞，则每克DNA仅能产生104～105的噬菌斑，说明感染效率比转染效率高出104～105倍，从而大大提高基因文库的库容量。

（2）外源DNA导入真核微生物细胞

外源DNA导入真核微生物细胞，一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成原生质体，再用Ca Cl2和聚乙二醇处理，重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。

3.基因文库与cDNA文库的构建

利用重组DNA技术，可将某一原核微生物或真核微生物染色体基因组的全部遗传信息贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库（genomic library）或cDNA文库（cDNA library）之中，犹如将文献资料贮存于图书库一样，以供长期贮存和随时调取克隆基因使用。

（1）基因文库的构建

所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部DNA序列。

基因文库构建的步骤可简单归为：① 从组织或细胞提取基因组DNA；② 用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的DNA片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片段；③ 通常采用λ噬菌体或柯斯质粒载体等容载量较大的克隆载体，在适当位点将载体切开；④将基因组DNA片段与载体进行体外连接；⑤ 重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组λ噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。

（2）cDNA文库的构建

所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。

由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但由于细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15％左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应较基因文库小。

构建cDNA文库的主要步骤为：① 从生物体或细胞中提取mRNA；② 利用逆转录酶以寡聚（d T）或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的一条链；③ 利用DNA聚合酶Ⅰ ，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可合成第二条链；④ cDNA与载体的体外连接；⑤ 噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。

cDNA文库比克隆和表达真核微生物基因更为重要。因为真核微生物的基因含有内含子，在原核微生物细胞中不能表达，但筛选到的cDNA克隆只要附上原核微生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。此外，cDNA还代表了基因组表达的遗传信息。

4.重组体的筛选与鉴定

在构建文库之后就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。这通常有三种鉴定方法：一是重组体表型特征的鉴定，二是重组DNA分子结构特征的鉴定，三是外源基因表达产物的鉴定。

（1）重组体表型特征的鉴定

1）抗生素平板法。如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养平板上进行培养，仍可长出菌落。此外，还有一些自身环化的载体和未被酶解的载体，它们的转化细胞也能在含该抗生素的平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法的缺点是假阳性高。

2）插入失活法。因外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（insertional inactivation），插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体（图7-4）。

3）插入表达法。在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源DNA片段插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。例如质粒p TR262有一个负调控的cⅠ基因，当外源DNA片段插入cⅠ基因中的BcⅡ或HindⅢ位点，造成cⅠ基因失活，位于cⅠ基因下游的tet基因（受cⅠ基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落；而未被酶解的质粒的转化细胞及未转化受体细胞均不能形成菌落。

4）β-半乳糖苷酶显色反应法。某些载体，如M13噬菌体载体、p UC质粒系列、p GEM质粒系列等，p BSK（＋／－）上带有（-半乳糖苷酶基因（lac Z）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏lac Z的阅读框架，不影响其正常功能。E.coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，p BSK（－）和DH5α融为一体的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在p BSK（－）和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lac Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac＋细菌较易识别，它在生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的存在下被IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到p BSK（－）质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac＋细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。因此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。

（2）重组DNA分子结构特征的鉴定

1）菌落（或噬菌斑）原位杂交（in situ hybridization）。将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出DNA。再用碱处理，使DNA变性，经烘烤将变性DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。通常影印的滤膜必须有双份，在一张滤膜上找到阳性克隆后，可在另一张滤膜的相应位置上找到活的细菌或噬菌体克隆。此法的优点是可在短时间内从成千上万克隆中筛选到阳性克隆。

2）内切酶图谱鉴定。将初步筛选的阳性克隆少量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1～2种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段的大小。

3）PCR鉴定。通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒DNA作为模板进行PCR分析，可快速测出插入DNA片段的大小及鉴定其序列特异性。

4）DNA序列测定。最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。

（3）外源基因表达产物的鉴定

1）表达产物免疫活性测定。如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有的抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法实验操作相似于菌落（或噬菌斑）原位杂交。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。如果用的是放射性标记抗体，则免疫反应后进行自显影；若用的是酶偶联（酶标）抗体，那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。

2）表达产物生物活性检查。可根据表达产物不同情况采用不同方法检测其生物活性。

3）表达产物氨基酸序列测定。测定表达产物的“N”端氨基酸序列，对表达产物的鉴定具有特别重要意义。