－的克隆与表达

7．3．6　hEC－SOD的克隆与表达

hEC－SOD可以在大肠杆菌BL21（DE3）中以包含体的形式进行表达，一定浓度范围内用乳糖和IPTG对其表达进行诱导对hEC－SOD的表达量影响不大，但在不同菌体密度（OD_600nm）条件下进行诱导，对hEC－SOD包含体产量有所影响，在LB培养基中摇瓶条件下培养时，菌体密度（OD_600nm）为0．6～0．8时可以得到较多的包含体。温度对hEC－SOD包含体的表达有显著影响，低温条件下，可以降低目的蛋白的表达量，使部分蛋白在超声上清中以可溶的形式进行表达。

hEC－SOD在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS也可以进行表达，但表达量比在大肠杆菌BL21（DE3）中有较大程度的降低。部分蛋白以可溶形式在超声上清中进行表达，部分蛋白以包含体的形式存在于超声后的离心沉淀中。用金属离子螯合柱Ni ^2＋－Sepharose和肝素亲和柱Heparin－Sepharose可以对可溶表达的蛋白hEC－SOD进行纯化，但蛋白活性较低，可能以可溶形式表达的蛋白并没有完全正确折叠。

采用基因工程的手段克隆表达hEC－SOD是大量获取hEC－SOD的重要手段。hECSOD在大肠杆菌中以包含体的形式大量表达，由于其结构中含有较多的二硫键，虽然我们对其体外复性条件进行了优化，但包含体复性效率依然较低。在今后的研究中可以尝试在真核细胞，如酵母细胞或者哺乳动物细胞中进行表达。一方面在真核细胞里表达不会产生包含体，可以解决包含体复性效率低的问题，另一方面，由于真核细胞含有蛋白后加工系统，可以实现hEC－SOD的糖基化，使其结构与天然结构一致，不仅可以提高其稳定性，对其胞外的靶向定位也有积极作用。

采用稀释复性的方法可以实现hEC－SOD包含体的复性，但复性效率不高。复性过程中许多因素，如pH、温度、添加剂、氧化还原对比例及复性方式等均可以影响复性效率，因此对复性条件进行优化具有十分重要的意义。蛋白复性后其紫外吸收光谱比复性前发生显著变化，显示复性后蛋白结构发生变化。hEC－SOD复性后的蛋白可以用IMAC和肝素亲和柱对其进行纯化，经肝素亲和柱纯化后，蛋白比活性明显提高。