基因克隆及表达特征分析

SOD 是生物体内一种重要的抗氧化酶类，它几乎存在于各种需氧生物中。根据SOD 结合的金属离子的不同，可将SOD分为FeSOD、MnSOD、Cu/ZnSOD、NiSOD和Fe/ZnSOD 五种。十足目甲壳动物体内只含有MnSOD 和Cu/ZnSOD，根据亚细胞定位的不同，MnSOD又可以分为两类，一类是存在于线粒体中的MnSOD，称为线粒体MnSOD（mMnSOD），另一类是存在于胞质中的MnSOD，称为胞质MnSOD（cMnSOD）（Brouwer et al，2003）。

本研究通过RACE方法克隆了三疣梭子蟹这cMnSOD基因 cDNA 全长，进一步利用定量PCR方法对它们在三疣梭子蟹正常组织的分布情况和溶藻弧菌感染后在血细胞和肝胰脏中的表达变化分别进行了研究。

4.1.1　cMnSOD基因克隆及序列分析

三疣梭子蟹cDNA全长为1.1.6　bp，其中开放阅读框为861个碱基，编码286个氨基酸；cDNA全长中还包含59非编码区（59-UTR）的18个碱基、39非编码区（39-UTR）的167个碱基及终止密码子TGA和加尾信号AATAAA。由于该基因编码的 MnSOD是胞质型，即合成多肽后仍驻留在细胞质中，所以其氨基酸序列中不像mMnSOD那样含有信号肽。该基因所编码蛋白的推导相对分子质量为31475.76，理论等电点为6.33。该基因Genbank注册号为FJ031018。

4.1.2　cMnSOD基因表达特征分析

采用定量RT-PCR方法分析了cMnSOD基因在三疣梭子蟹不同组织中的表达情况（图61）。从图中可以看出，cMnSOD 基因在血细胞、肝胰脏、鳃、心脏、卵巢和肌肉中转录水平均较高。

图61　RT-PCR检测三疣梭子蟹不同组织中cMnSOD基因的表达情况。1.血细胞；2.肝胰腺；3.鳃；4.心脏；5卵巢；6.肌肉；7.胃；8.肠

图62　 MnSOD基因在V. alginolyticus 感染组和对照组三疣梭子蟹血细胞、肝胰腺内的表达变化

在溶藻弧菌感染后三疣梭子蟹血细胞内cMnSODmRNA的表达变化如图63所示。在感染后的前3h里，感染组和对照组cMnSOD的转录均呈上升趋势，在感染6 h达到最高水平，且试验组与对照组差异显著（P , 0.05）；感染后6 h～12 h，感染组和对照组mMnSOD的转录呈下降状态，在感染12 h达到最低水平。对照组基本保持在正常水平；而感染组mMnSOD的表达量从6 h后一直下降。在感染后72 h、96 h感染组cMnSOD表达量的显著性低于对照组（P , 0.05）。感染组和对照组mMnSOD 表达量显著性差异（P , 0.05）主要出现在感染后的3 h、72 h和96 h。

溶藻弧菌感染后三疣梭子蟹肝胰脏内cMnSODmRNA 的表达变化如图62所示，从图中可以看出，在感染后1.5 h，与对照组比较，感染组cMnSOD的转录水平显著升高（P , 0.05），从感染3 h后，随着感染时间的延长，感染组cMnSOD的转录水平呈逐渐下降的趋势，到感染后72 h和96 h时，cMnSOD 的转录降低到了很低的水平。感染组和对照组mMnSOD 表达量的显著性差异（P , 0.05）主要出现在感染后的1.5 h、3 h、24 h、72 h和96 h。