三疣梭子蟹抗氧化系统相关基因的克隆表达分析

三疣梭子蟹是我国重要的渔业捕捞对象和海水养殖对象（戴爱云等，1986），养殖规模逐渐增加。但是近年来，随着三疣梭子蟹养殖规模的不断扩大、种质资源的破坏、养殖环境的污染等问题严重损害了其免疫防御系统，导致虾、蟹类自身的免疫抗病力下降，对病害的易感性增加，疾病频繁发生，例如白斑病毒（WSSV）和溶藻弧菌（Vibrio parahaemolyticus）均可以引起梭子蟹的急性感染，导致大量发病及死亡。虽然抗生素和其他化学药物可用来防治蟹类的急性感染，但从使用抗生素等药物的安全性、抗药性以及食品安全性等方面考虑，兼之药物不能有效地解决蟹类疾病防治问题，然迄今三疣梭子蟹免疫学的知识还很少；三疣梭子蟹免疫系统的组成及特点、免疫因子的产生规律、免疫因子的性质及细胞免疫和体液免疫防病的作用机理尚未进行研究（Lee & Söderhäll，2002）。因此，根据其他虾、蟹等甲壳动物免疫特性的研究技术及方法，对三疣梭子蟹免疫性状及免疫因子等方面进行深入研究，探明影响其免疫特性的因素，寻找三疣梭子蟹疾病防治的有效方法，可以从根本上解决蟹病造成严重损失的问题，进而提高我国三疣梭子蟹养殖的产量和质量。

目前研究表明，当甲壳动物机体受到病原微生物刺激时，呼吸爆发和其他免疫中产生的大量活性氧也会在细胞内积累，破坏机体细胞内的功能蛋白分子、不饱和脂肪酸分子和核酸等，对细胞造成严重的伤害。Mohankumar等（2006）研究指出，印度明对虾（F. indicus）在感染WSSV 后，血淋巴、肝胰脏、鳃和肌肉等组织中磷酸酯酶（包括Na KATP酶、Ca ATP 酶、Mg ATP酶等）活性明显降低，这可能是由于呼吸爆发产生的ROS 破坏了磷酸酯酶的巯基（-SH）所致；这些组织中的转氨酶（包括丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶）活性显著上升，推测其原因可能是由于脂膜的过氧化导致转氨酶泄漏所引起。同时，与对照相比，WSSV 感染后的对虾线粒体内酶的活性也显著降低。另外，Mohankumar 等（2006）还研究了印度明对虾感染WSSV 0 h、24 h、48 h、72 h后对虾细胞内抗氧化酶活性的变化。结果发现，感染后的不同时间里，在对照组和WSSV感染组对虾的血细胞、肝胰脏、鳃、肌肉等组织中，脂质过氧化水平、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性以及非酶抗氧化剂谷胱甘肽巯基转移酶、还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶的活性有显著性差异。与未感染的对照组相比，感染组对虾超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽巯基转移酶、还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶的活性呈极显著的下降，在WSSV感染对虾体内由于活性氧等自由基造成的氧化压力使其抗氧化清除系统过度损耗，从而导致细胞内脂质过氧化水平上升。本研究克隆了三疣梭子蟹cMnSOD、ecCuZnSOD、CAT、Prx等抗氧化系统相关的基因，完成了基因序列分析、组织表达及病原感染后的表达情况，为研究抗氧化系统在疾病防控中的作用提供了理论依据。

实验所用三疣梭子蟹（体重140～160 g）购于青岛日照三疣梭子蟹养殖场，运回实验室后在200 L PVC桶中充气暂养10天，使其适应实验室内养殖环境。将溶藻弧菌配置成2.3.108　cell/mL浓度梯度。从每只三疣梭子蟹第三对步足基部注射300 μL作为感染组；对照组注射等体积无菌生理盐水，在梭子蟹注射感染后0 h、1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h分别取蟹5只，取血淋巴、肝胰腺等组织用于RNA提取用于实验。