中国百里香属植物资源亲缘关系的分子系统学研究

由于百里香属植物具有丰富的生态多样性及化学多型性的特点，而且很容易发生近缘种间的杂交和基因渗透，给部分种特别是近缘种的分类及系统地位的确定带来了较大的困难（Thompson et al.，1998）。特别是对于地椒、地椒亚洲变种、地椒展毛变种和百里香这几个种（变种）的植物学分类和鉴定更加复杂，这些种（变种）在属内的亲缘关系和系统地位一直不够明确。分子生物学技术为从分子水平揭示生物系统进化的本质提供了可能，在系统重建和探讨用经典分类学难以确定的一些分类问题方面发挥了重要的作用，已被广泛应用于植物系统学的研究中（阮成江等，2005）。转录间隔区（ITS）是核糖体基因中位于核糖体大小亚基之间，核糖体小亚基与5S rRNA之间的区域，由于不加入成熟核糖体，受到的选择压力较小，进化速度较快，常用于种和亚种的系统分析，这一领域的研究在国内外均取得了重要进展（王林玲等，2006；薛华杰等，2007；喻达辉等，2006；张利等，2007；Ainouche et al.，1997；Baldwin et al.，1995；Shi et al.，2002）。ISSR （Inter Simple Sequence Repeats，简单重复序列间扩增）分子标记技术因其具有快速、简便、可靠以及可以揭示出比RAPD、RFLP、SSR等标记更高的多态性等特点，也已被广泛用于多种植物的种间及种下居群间的系统进化和亲缘关系研究之中（李萍等，2007；杨小艳等，2007；朱云华等，2007）。本研究拟采用以上两种分子系统学的研究方法，将核糖体ITS转录间隔区序列测定与ISSR分子多态性分析技术相结合，其结果可为中国野生百里香属植物资源的分类和系统进化学研究及属下近缘种和变种的分子鉴定提供一定的理论依据。

将ITS序列分析和SRAP分子标记技术相结合，对20份分布于中国的野生百里香属资源（5个种2个变种）及2份国外百里香属资源（2个种）进行了属内种间及种下水平的系统发育和亲缘关系研究。得到如下结果：以牛至（Origanum vulgare）为外类群的ITS区序列的系统发育树能较好地说明百里香属种间的亲缘关系，可将9个种（包括2个变种）中的5个明显分开并单独聚为一组；地椒、地椒亚洲变种、百里香和铺地百里香聚为一组，得到94%的自展支持率，表现为较近的亲缘关系。同时地椒怀远居群和地椒展毛变种兴凯湖居群各聚为单独的一组，位于系统发育树的底部，自展支持率达到100%，与其他材料间遗传距离有显著的遗传差异。进一步对地椒、地椒亚洲变种、百里香以及地椒展毛变种兴凯湖居群和地椒怀远居群进行ISSR遗传多态性及聚类分析，结果发现地椒展毛变种兴凯湖居群和地椒怀远居群仍各自单独聚为一组，与地椒、地椒亚洲变种、百里香三者之间的遗传相似度较低；地椒与地椒变种各自聚在一起后共同聚为一组，百里香单独聚为一组。将本试验结果结合野外考查及形态学观测比较，我们认为，地椒、地椒亚洲变种和百里香三者属于近缘种，并与国外的铺地百里香有很近的亲缘关系，故有些文献将以上三种均列为铺地百里香的变种是有一定理由的；其次地椒展毛变种兴凯湖居群无论从形态学比较、地理分布，还是从ITS序列及ISSR多态性分析看均与其他种及变种间有很大的形态及遗传差异，支持《东北植物志》将其从地椒展毛变种中分出，列为单独的一个种；另外地椒怀远居群虽然从形态上与地椒和百里香很相似，但野外调查结合本研究结果均表明，地椒怀远居群在遗传背景及分布生境上有很大的特殊性，属于中国百里香属中较为进化的类群，其在百里香属植物中的系统地位还需进一步研究。

一、试验方法

（一）供试材料

本试验包括7个种2个变种及部分种下居群共计20份材料（表1）。其中1～17号材料均为野外实地采集获得，18号材料来自新疆中药民族药研究所标本室，19号、20号材料来自新疆石河子大学种苗快繁基地。以上凭证标本均保存于江苏省中国科学院植物研究所标本馆中。每份材料选取2个单株用于ISSR标记分析，ITS测序为无性系单株的混合样。野外采摘的幼嫩茎端叶片部分以及标本上取得的干燥叶片，均放入变色硅胶后密封带回，充分干燥后存放于－80℃冰箱中待用。

表1　试验材料基本情况

（续表）

（二）DNA提取与质量测定

野外采集的叶片采用改进后的周延清（2005）的CTAB快速提取法提取DNA，在2%的CTAB提取液中加入等体积3%的β-巯基乙醇，并用等体积的氯仿—异戊醇混合液（V氯仿∶V异戊醇=24∶1）抽提两次；标本上采集的叶片均使用南京天威公司的DNA提取试剂盒提取。以上方法获得的DNA进行以λDNA浓度为参照的1.0%的琼脂糖电泳，检测DNA的纯度及含量，将供试的DNA用TE稀释至20～30 ng·μL-1后存放于-20℃环境下备用。

（三）ITS的PCR扩增测序及分析

ITS区引物序列为ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），直接进行PCR扩增。扩增反应在PE-9700上进行，20μL反应体系如下：60 ng DNA模板，2.5mmol·L-1mgC12，0.15mmol·L-1dNTP，0.3mmol·L-1引物，Taq酶1.25 U，10×Buffer。扩增程序为94 ℃3min；94 ℃45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃1min，35个循环；最后72 ℃5min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶系统观测，Gel Doc图像分析仪观察。PCR产物经试剂盒回收纯化后直接测序，测序引物为PCR引物。引物合成及ITS序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。

各材料测定的ITS序列结果与GenBank中的百里香属植物的ITS序列进行Sequencer软件比对，确定序列范围及间隔区的位置，将序列对位排列并辅以人工校对，采用MEGA 3.1软件中的最大简约法（Maximum Parsimonymethod）与邻接法（Neighbor-joiningmethod）构建ITS树，进行系统发育分析。在最大简约法分析中，采用树二组重新连接（TBR）、启发式搜索（Heuristic search）、随机添加100次重复、自展（Bootstrap）重复1000次等选项完成。在邻接法分析中，计算各序列间的分化距离，并用自展法进行检测，自展数据集为1000次。以上分析中空位（gap）均作缺失（missing）处理。在构建系统树时，以GeneBank上公布的近缘属牛至属（Origanum）的牛至作为外类群。

（四）ISSR引物的筛选、PCR扩增及数据分析

本试验所用的90个ISSR引物参考美国哥伦比亚大学UBC公司公布的ISSR引物序列合成。

ISSR-PCR反应体系为：在20 μL的基础扩增反应体系中，DNA为30 ng，Mg2+为2.5mmol·L-1，dNTPs为0.15mmol·L-1，引物为0.4mmol·L-1，Taq DNA聚合酶为1 U，10×Buffer 2 μL。然后加入1滴石蜡油离心后放入基因扩增仪进行PCR扩增。扩增程序为94 ℃预变性3min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1min 30 s，38个循环； 72 ℃延伸5min，4 ℃保存。对ISSR-PCR的扩增产物进行1.3%的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统拍照，Gel Doc图像分析仪观察。

对ISSR-PCR扩增条带进行人工统计，在某一位点上依据条带的有或无分别记为1或0，输入Excel表中形成二元数据矩阵，在此数据基础上采用POPGENE Version 1.31软件计算出供试材料的多态位点百分率（Percentage of Polymorphic Bands）及Nei's 遗传距离（Genetic Distance）和遗传一致度（Genetic Identity），采用MEGA 3.1软件进行UPGMA聚类分析。

二、结果与分析

（一）百里香属植物种间的ITS序列分析

1.百里香属植物的ITS序列特征

对20份不同来源的百里香属材料（包括7个种2个变种）进行ITS序列的统计分析表明，供试百里香属材料的ITS序列长度（包括ITSl，5.8S及 ITS2的全长序列以及18S、26S的部分序列）变化范围为653～701 bp，经Sequencer软件对位排列并辅以人工矫正后，得到601 bp的ITS全长用于分析比较，其中ITS1、5.8S和ITS2的序列长度分别为192 bp、164 bp和241 bp（表2）。在不引进外类群时，变异位点数为75个，其中信息位点数为26个，占全序列的4.3%，单核苷酸变异位点数为49个，占全序列的8.2%。所有信息位点的96%都分布在ITS2间隔区内，且无论有无外类群存在，在5.8S范围均无信息位点，只有部分单核苷酸变异位点存在，说明5.8S具有很好的保守性，百里香属种间ITS序列变异主要存在于ITS2间隔区内。

表2　试验材料ITS序列特征分析

注：VN表示变异位点数；PiN表示信息位点数；SN表示单核苷酸变异位点数

2.基于ITS序列的百里香属种间遗传距离分析及分子系统树的构建

对供试百里香属植物的ITS序列统计表明，百里香属内种间碱基差异百分率为2.6%，其中转换率为1.9%，颠换率为0.7%；属内各物种间遗传分化距离的变异范围为0.000～0.169，平均值为0.026。地椒、地椒亚洲变种和百里香之间的遗传分化距离均为0.000，另外这3个种与国外的铺地百里香之间虽然有遗传分化存在，但遗传分化距离值仅为0.002，根据屈良鹄（1999）等发表的被子植物大多数科属的ITS序列的属内种间差异值为0.012～0.102，说明地椒、地椒亚洲变种、百里香和铺地百里香之间亲缘关系很近。属内其他种间遗传分化距离均大于0.016，值得注意的是，地椒怀远居群和地椒展毛变种的兴凯湖居群与其他种及变种间的遗传分化距离均达到0.055以上，最高达到0.145。

根据ITS序列以近缘牛至属植物牛至作为外类群通过邻接法和最大简约法分别构建N-J邻接（Neighbor Joining）树和MP（Maximum Parsimony）树，所构建的系统树有着相似的拓扑结构，本研究选择N-J邻接树（图1）进行供试百里香属的分子系统亲缘关系分析。根据系统发育树可以看出，地椒（除怀远居群）、地椒亚洲变种、百里香和铺地百里香聚为相同的一组无法再分，自展值达96%，说明它们之间确实具有很高的遗传相似度，亲缘关系很近，ITS序列分析也无法将其区分开；短节百里香、黑龙江百里香、异株百里香和法国百里香各单独聚为一组，自展支持率分别为97%、75%、67%和99%；地椒展毛变种兴凯湖居群和地椒怀远居群聚为一组，处于系统发育树的底部，自展支持率达100%，与其他材料之间遗传关系较远。

图1　基于核糖体ITS序列的百里香属系统树

注：**表示外类群；分支上的数值代表自展支持率；材料编号同表1

（二）基于ISSR多态性标记的百里香属近缘种种间及居群间的亲缘关系分析

由于ITS序列构建的系统发育树无法将中国百里香属内地椒、地椒亚洲变种及百里香三者之间很好地区分。为更好地了解地椒、地椒亚洲变种及百里香系统发育与亲缘关系，进一步探明地椒怀远居群和地椒展毛变种（兴凯湖居群）在中国百里香属植物中的系统地位，对以上百里香属近缘种种间及种下居群间进行了如下ISSR多态性比较与聚类分析。

1.ISSR标记的多态性分析

从90条ISSR引物中选出扩增片段清晰、多态性和重复性较好的10条ISSR引物对百里香属地椒、地椒亚洲变种、地椒展毛变种及百里香进行种间及种内居群间的扩增比较及数据分析，引物序列及检测的位点数见表3。10条ISSR引物共扩增96个条带，其中多态性条带为84个，多态性条带百分比为87.5%，不同引物扩增的DNA大小在200～1500 bp之间。引物ISSR-56的ISSR-PCR扩增结果见图2。

表3　ISSR引物序列及条带统计

图2　引物ISSR-56对百里香属近缘种及居群的ISSR扩增图谱

注：M为2000 bp DNA Ladder；1～15为百里香属不同材料，每份材料2个单株

2.基于ISSR标记的遗传距离及聚类分析

对百里香属地椒、地椒亚洲变种、地椒展毛变种及百里香的ISSR标记的遗传距离分析表明，地椒展毛变种兴凯湖居群和地椒怀远居群与其他材料间的遗传距离显著高出种内其他材料间的遗传距离，其变化范围分别为0.4654～0.6869和0.3355～0.5588；地椒、地椒亚洲变种和百里香间的遗传距离相对较近，其中地椒和地椒亚洲变种间的遗传距离变化范围为0.1371～0.3537，百里香与地椒间的遗传距离变化范围为0.1418～0.3514，百里香与地椒亚洲变种间的遗传距离变化范围为0.1418～0.3514；地椒、地椒亚洲变种及百里香的种（变种）下不同居群的遗传距离也较近，变化范围分别为0.1070～0.3103、0.1342～0.1878和0.1568～0.3170，且种群间聚类与地理分布距离表现出一定相关性。

POPGENE聚类分析也很好地体现出以上材料间的遗传关系（图3），地椒展毛变种兴凯湖居群和地椒怀远居群各单独聚为A、B两支，百里香、地椒和地椒亚洲变种共同聚为C组，在C组之下百里香不同居群聚为一组C1，地椒与地椒亚洲变种聚为一组C2，在C2组内地椒与地椒亚洲变种又各自聚在一起。以上结果再次表明地椒展毛变种兴凯湖居群和地椒怀远居群与其他材料间确实亲缘关系较远，而地椒、地椒亚洲变种和百里香三者之间遗传关系较近，属于近缘种。

图3　百里香属近缘种种间及居群间ISSR标记聚类图

注：图中材料编号同表1

三、讨论

（一）各试验材料的系统地位及亲缘关系

百里香属植物在中国长江以北的各省均记载有分布，但在《中国植物志》记载的12个种中，有3个种仅在新疆有分布，有6个种仅在黑龙江、内蒙古东北部有分布，其他地区分布的百里香属植物均为地椒、地椒变种或百里香，且这几个种（变种）往往有着共同的地理分布区域。通过前期对大量百里香属植物的标本查阅和野外调查工作发现，中国百里香属的地椒、地椒亚洲变种和百里香这3个种（变种）有着广泛的生态适应性，且生态多型性较为明显。本研究结果也表明，虽然通过ITS序列分析能较好地说明供试百里香属种间亲缘关系，却无法将地椒、地椒亚洲变种和百里香种分开。结合进一步ISSR标记多态性分析发现，中国百里香属地椒、地椒亚洲变种和百里香之间确实有着很近的亲缘关系，这可能是长期天然杂交和基因交流造成的结果。基于IST序列构建的系统发育树分析还表明，这3个种（变种）与国外的铺地百里香有着很近的亲缘关系。Bean（1980）认为铺地百里香是一个非常复杂的类群，可以把分布于欧洲大陆到东亚的许多百里香属植物均看作属于这一类群。因此从以上分析看，国内有些文献将地椒、地椒亚洲变种和百里香均列为铺地百里香的变种是有一定理由的，但以上解释仍不够充分，要真正明确它们在百里香属内的系统地位还需要更多证据。

（二）地椒展毛变种兴凯湖居群的系统学地位

关于地椒展毛变种兴凯湖居群的系统学地位应给予重新考虑。《中国植物志》中将兴凯湖百里香作为地椒展毛变种加以对待，而《东北植物志》则支持兴凯湖百里香作为一个独立的种。野外调查及观测表明，兴凯湖百里香生长于黑龙江兴凯湖岸边的沙堤之上，具有独特的生境分布，而且在叶色、叶形、挥发性气味及植株形态等方面均与地椒有很大差异。从本试验分析也可以看出，兴凯湖百里香居群不仅与地椒和地椒亚洲变种之间有较大的遗传差异，而且与百里香属内其他种间也存在较大的遗传分化，亲缘关系较远，系统发育树和聚类分析均将其明确列为单独一支。综合以上分析，我们认为应重新明确地椒展毛变种兴凯湖居群在百里香属内的系统学地位，不应将其看为地椒种的变种——地椒展毛变种，而支持《东北植物志》中将其当作独立的种——兴凯湖百里香（T.przewalskii）予以对待。由于地椒展毛变种的其他种群材料未能收集到，故地椒展毛变种与百里香属其他种及变种间的亲缘关系及系统地位的确定仍需进一步研究。

（三）地椒怀远居群在百里香属中的分类地位

地椒怀远居群在百里香属中的分类地位急需进一步明确。田自强等于1996年在安徽怀远县首次发现有百里香的分布并将其归入地椒种中（田自强等，2001）。本试验研究结果对该种的分类地位却提出很大的疑问。首先，通过ITS序列分析及构建的系统树表明，地椒怀远居群与百里香属其他种间遗传距离较远，而与地椒展毛变种兴凯湖居群聚为一组，有着较近的亲缘关系，均属于较为进化的类型。ISSR标记的聚类结果也表明，地椒怀远居群与地椒、地椒变种和百里香三者之间表现为种一级的聚类，地椒怀远居群被单独聚为一组，而另外3个种（变种）被聚为一组；其次野外调查发现，安徽怀远是中国百里香属植物的最南端分布地区，位于淮河南岸的涂山上，这里属于温带半湿润气候类型，在整体的生境方面与其他任何分布区均有很大差异。基于以上研究结果我们推测，虽然从植物形态学分类上很难将地椒怀远居群与地椒、地椒亚洲变种和百里香区分开来，但由于在外部生境与内部DNA水平变异的综合作用下，地椒怀远居群在群体水平上发生了很大的遗传分化，极有可能已经进化为一个新的种或变种。相反地椒怀远居群虽然与兴凯湖百里香在形态上差别很大，但ITS序列的系统发育树却将两者聚为一组（自展支持率达100%），且两者均为百里香属中较为进化的类群，两者有着较近的亲缘关系。因此对怀远居群在中国百里香属内的分类地位的确定以及与兴凯湖百里香之间的亲缘关系问题，还需结合孢粉学、细胞学、植物化学等多方面的证据进行综合评价。

（四）分子系统学研究方法在植物分类中的应用

目前分子系统学的研究方法在植物系统分类及亲缘关系研究方面得到越来越广泛的应用，已成为植物分类学的一个重要研究领域。但需要注意的是，针对不同植物及不同分类地位的系统学研究要选择适合的DNA序列和分子标记方法，否则会导致试验结果混乱甚至结果不可信。从本试验研究可以看出，将核糖体ITS序列分析和ISSR分子标记的技术相结合，综合地进行百里香属内种（变种）间及种下居群间系统进化及亲缘关系的研究是较为完整和可行的。