基因表达载体的构建，即目的基因与载体的结合，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。基因工程中常用的载体有5类，分别为质粒（见图7.9）、单链DNA噬菌体M13、λ噬菌体的衍生物、cosmid柯斯质粒（黏粒质粒）和动物病毒。根据功能载体又可分为克隆载体（克隆一个基因或DNA片段）、表达载体（用于一个基因的蛋白表达）和整合载体（把一个基因插入到染色体组中）。
图7.9 质粒载体示意图
克隆载体的构建。天然质粒克隆载体如pSC101存在分子量大、拷贝数低、筛选标记不理想等局限性，因此需要对天然质粒进行改造，获得具有复制起点、抗生素抗性基因、若干限制性内切酶的单一位点，具有较小的分子量和较高的拷贝数的人工构建的质粒载体。经典的大肠杆菌质粒载体包括ColE1，pBR322，p UC系列（p UC7，p UC8，p UC9，p UC10，p UC11，p UC18，p UC19）。λ噬菌体由于其高效的感染性和自主复制繁殖性被开发为克隆载体，且其容量比质粒载体大得多，常用的有β-半乳糖苷失活插入型载体、免疫功能失活插入型载体、Charon系列取代型载体、λEMBL系列取代型载体、Spi-正选择取代型载体、λZAP插复制、表达和选择。Ti质粒表达载体是利用T-DNA可携带DNA片段并整合到植物基因组的特性，对天然Ti质粒进行改造，用于植物转基因载体。Ti质粒载体系统又分为一元表达载体系统和双元表达载体系统（见图7.11）。一元表达载体又称共整合载体系统，需要同源重组才能插入外源基因。如pGV3850是一种受体质粒，外源质粒不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。双元表达载体系统是由两个分别含有T DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统，其中含有T-DNA的微入型载体。丝状单链DNA噬菌体有M13，f1和fd，具有不存在包装限制问题、容易测定外源DNA片段的插入取向等优越性。cosmid载体（黏粒载体）是由λ噬菌体的cos末端及质粒重组而成的载体，其带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记及λ噬菌体用于包装的cos末端等（见图7.10），它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA形式存在于细胞中。
表达载体的构建。包括原核表达载体（原核细胞中表达外源基因）、酵母表达载体和Ti质粒表达载体。其中酵母是真核表达的首选系统，酵母表达载体实际是一种穿梭表达载体，它既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中型质粒为一种穿梭载体，而另一个是含有Vir区，用于激活T-DNA转移的辅助Ti质粒（由经改造的农杆菌菌株EHA105，GV3101等提供）。构建双元表达载体系统，用一定的限制酶切割微型质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性/平末端。通过双切双连或者利用同组酶进行同源重组的方法将目的基因连接到载体上，形成重组DNA分子。
图7.10 黏粒质粒载体构建过程
图7.11 Ti表达载体
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