基因表达的重编程

哺乳动物的发育是一个高度有序的生物学过程，是从一个全能的受精卵开始，到建成一个由200多种具有组织和细胞特异性的、结构和功能各异的细胞组成的整体的过程。组成机体的各个组分之间的协同能执行精细、复杂且相互协调的功能，如物质和能量代谢，对病原生物的抵御和免疫能力的获得，高级神经系统功能网络的建立，两性生殖细胞的发生、成熟和受精后的新生命孕育，以及与复杂多变环境之间的相互作用等。对于一个生物机体来讲，所有结构和功能各不相同的细胞虽具有完全一样的基因组，却有着很不一样的基因表达模式。与组织和细胞特异性的基因表达模式的建立和维持相关的细胞信息，必须是可以通过细胞分裂而遗传的，DNA甲基化和DNA相结合的组蛋白的结构修饰等表观遗传修饰标记对于稳定且可遗传的染色质构型的维持和基因表达的调控起着重要的作用。那么，在发育和分化过程中建立的不依赖基因组序列的基因表达模式，或者说基因组的表达程序是不是在发育和分化过程中也应该具备被删除和重建的潜在可能性呢？

1962年英国发育生物学家格登（J.B.Gurdon）将美洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪的小肠上皮细胞核移植至去除了细胞核的卵，结果发现一部分卵依然可以发育成蝌蚪，其中一部分蝌蚪还可以继续发育成为成熟的爪蟾。格登的发现证实，一个已经完成结构和功能分化的上皮细胞核也能够借助去核卵细胞发育成为一个蝌蚪，进而发育成一只成熟的爪蟾。这也是利用体细胞在实验室克隆动物的第一次成功。

1997年英国科学家威尔穆特（I.Wilmut）和K.坎贝尔（K.Campbell）应用与格登类似的核移植技术，将一只6岁成年母羊的乳腺上皮细胞核移植至去核卵细胞，获得了哺乳动物体细胞克隆的第一次成功，迎来了名为“多莉（Dolly）”的克隆绵羊的诞生。这件事雄辩地证明：一个来自成熟的哺乳动物的高度分化的体细胞仍然保持发育成为完整个体的能力，也就是说细胞的分化并没有造成不可逆的遗传物质修饰。哺乳动物细胞的分化是通过基因表达水平的一系列有序演化，以及细胞核和细胞质内环境的相互作用来实现的。然而体细胞核移植的成功率极低，至少有1/3的克隆动物胚胎因胎盘发育异常而早期流产。出生后24 h内，又有大量克隆动物死于呼吸异常、出生时体重超重、心血管系统缺陷、器官增大或畸形等。即使度过了胚胎期和围产期而存活下来的动物还会频频出现免疫系统、中枢神经系统和消化系统缺陷或异常。2003年2月14日，年仅6岁的多莉羊也因不断恶化的肺部疾患被实施安乐死。

2006年，日本京都大学山中伸弥（S.Yamanaka）小组通过逆转录病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子导入成年小鼠的成纤维细胞，获得了与胚胎干细胞非常相似的诱导型多潜能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），表明已分化细胞的命运不是不可逆转的，进一步证实已经分化的哺乳动物体细胞有可能通过实验性的重编程（reprogramming）获得发育成为完整个体的发育潜能。此外，iPSC的诱导成功还使利用胚胎干细胞进行基础和临床的科学研究走出了伦理学困境，也为将患者的体细胞经过细胞体外操作逆转为iPSC后重新植入患者体内创造了条件。尽管，要让iPSC真正造福人类还要克服重重困难，还有很长的路要走，但山中伸弥的工作是一个里程碑。2012年，他和格登一起分享了诺贝尔生理学或医学奖。

图5-17从发育进程角度显示了细胞水平重编程技术路线。必须强调的是，将体细胞核移植或者其他可能出现的技术用于人体的克隆复制都是违反最基本的伦理原则的，是应该绝对禁止的。

图5-17　正常发育过程和细胞重编程技术路线比较（改自U.Grieshammer）

图5-18　个体发育过程中表观基因组的重编程（引自W.Reik和J.Walter）

早期原始生殖细胞在沿着生殖系管腔移行时，原属体细胞型的表观遗传修饰（基因组印迹）会被删除。在生殖细胞发生与成熟过程中表观遗传标记重新建立（蓝线表示精子分化，红线表示卵细胞分化）。受精后会进行除印迹基因以外的表观遗传修饰的删除与重建，重建后的表观基因组在组织特异性定型后被稳定地维持。

在自然条件下，基因组的表达程序在个体发育中也有一个被删除和重建的重编程过程。早期原始生殖细胞（primordialgerm cell，PGC）携有体细胞样的表观遗传型，在PGC进入性腺前后，这个表观基因组开始被删除。随之性别特异性和序列特异性的表观遗传型在两性生殖细胞中被建立。在受精过程中，精子进入成熟的卵细胞后，精卵融合形成的受精卵基因组在卵细胞质的生理环境中，会启动与胚胎发育相关，且有严格时空特异性的基因表达程序，即删除在生殖细胞成熟过程中建立的除印迹基因以外的全部表观遗传修饰标记，重新建立胚胎发育特有的表观基因组（epigenome）（图5-18）。也就是通过系统重建表观遗传修饰为胚胎发育中的基因表达重新编程。只有经过重新编程的表观基因组才具有发育的全能性，满足胚胎所有细胞发育和专一性分化的需要，才能为胚胎发育和分化发出正确的指令，小鼠胚胎的重新编程在着床前就完成了。胚胎发育中表观基因组重新编程的误差将会导致多种表观遗传缺陷性疾病。然而克隆动物的表观基因组更接近来自成年动物的供核细胞，这很可能是体细胞核移植克隆实验成功率极低的主要原因，也就是说体细胞核的重新编程往往难以完全成功。

另一个值得注意的问题是表观遗传修饰的重新编程对环境变化非常敏感。例如在动物实验中，改变胚胎培养液会引起异常甲基化和印迹基因IGF2和H19的表达失调，甚至造成印迹性疾病。有人还因此系统检查了人工辅助生育中的情况，因为辅助生育技术在配子生成和胚胎发育早期干预了生殖细胞，而这个时期正是表观遗传编程获得和维持的关键时期。奥斯塔维克（K.H.Orstavik）等曾报道经卵细胞胞质精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）辅助后出生的儿童中，PWS/AS和BWS发生率呈现增高的现象，并在患儿中检测到包括H19、IGF2在内的多个印迹基因表达异常。这些结果提示有必要对经辅助生育技术孕育的孩子做表观遗传学监测。

从1992年开始，简尼希（Q.Jaenish）运用遗传工程小鼠较为全面地探讨了重新编程问题。他发现如果将小鼠建立和维持DNA甲基化的DNA甲基转移酶的基因剔除，突变小鼠胚胎的多个器官会出现一系列异常表型，并都在胚胎发育早期夭折。实验有力地证明甲基化对于胚胎存活是很重要的。此后，简尼希一直以基因剔除的突变小鼠来研究表观遗传问题。在多莉羊问世后一年，他就成功地克隆了小鼠，并以此为工具来研究表观遗传学。他的实验表明，核移植克隆成功率极低的原因并不是遗传学问题，而是由于基因组表观遗传状态重新编程的失败。他还认为“所有的克隆（动物）都是不正常的。存活下来或活得稍长的克隆动物只是比早死的少一些异常而已。然而，他认为克隆技术却是研究表观遗传学的最公允的实验”。