拟南芥及过量表达转基因植株的获得

实验十六　拟南芥RNAi及过量表达转基因植株的获得

【实验目的】

掌握获得拟南芥RNAi和过量表达转基因植株的方法。

【实验原理】

在选择合适的转基因载体后，需要将目的基因构建到载体合适的位置。如图1-11中的pBI121质粒中有三个备用的限制性酶切位点，分别是Xbal I、BamH I和Smal I;图1-12中的pUbiO载体中的限制性单酶切位点有Sal I、BamH I、Kpn I、Sac I和Smal I。

由于植物具有自我剪切目的基因的功能，所以在构建过量表达目的基因的转基因载体时，可以是目的基因的开放阅读框，也可以是基因组序列。这里需要注意的是，构建基因组到转基因载体中，仅限于将目的基因转入植物中，如果是将基因在酵母或者是大肠杆菌中表达，则一定要构建基因的开放阅读框到合适的酶切位点。下面列出了构建的一般步骤，由于在这部分涉及的实验技术是基础的分子生物学实验技术，在本书的其他部分均已涉及，所以在这里没有列出详尽的实验步骤。

【实验方法】

根据基因的DNA序列，设计合适的引物，从植物基因组中克隆目的基因，并构建在T-载体中，进行测序验证;将验证后的基因从T-载体上酶切下来后，连接到转基因载体中;将连接有目的基因的转基因载体转入农杆菌中。这部分的实验方法见本节实验十四和实验十五。

1.利用农杆菌介导的转基因方法转化植株(以拟南芥为例)。

2.收获种子后进行抗性筛选，获得转基因的植株(具体方法参照实验八)。

【思考题】

1.利用农杆菌介导的转基因方法获得的T1代RNAi植株是否具有表现型?试分析原因。

2.RNAi或者是过量表达植株的表型分析是否一定要求是纯合体?如果不是，那么在什么情况下要求一定是纯合体，才能够正确分析转基因植株的表型?