实验十二 反转录及反向PCR检测特异基因的表达
一、实验目的
掌握从总RNA反转录cDNA第一链，并用第一链产物PCR检测特异基因的表达的技术和原理。
二、实验原理
RNA是从DNA转录的产物，基因有高拷贝、中等拷贝和低拷贝不同类型，高拷贝的基因转录产物很多，如28S，18S，5S RNA，在提取的总RNA中占很大比例，有明显的特异带，可作为提取总RNA质量的检测标记。很多低拷贝的基因是与许多特异功能相关的基因，带有polyA尾巴，可以作为一般性反转录引物polyT的模板，在反转录酶的作用下，在有四种dNTPs底物，以及防止Rnase降解的试剂、还原剂DTT的存在下，合成一条cDNA互补链。以这条互补链为模板，一对有关基因的特异引物，dNTPs，DNA聚合酶以及适当离子和pH条件下，进行PCR反应，大量扩增特异基因，从而检测其表达情况。
三、实验仪器、材料和试剂
1.仪器:水浴锅，PCR仪，电泳仪，电泳槽。
2.材料:实验十一获得的RNA。
3.试剂:反转录试剂盒ReverTra Ace-α-TM，TaqDNA聚合酶，扁豆CyclinG基因特异性引物:
F:5' CCAAGATGATGAGAAA3'Tm47.1℃
R:5' GTGACAAAAAAGGGGT3'Tm51.2℃
四、实验步骤
1.反转录cDNA第一链的合成:利用反转录试剂盒ReverTra Ace-α-TMReverse Transcriptase进行反转录cDNA第一链的合成，具体步骤如下:
(1)在一个无菌的1.5mL的离心管中配制反转录(RT)反应液Ⅰ，其中包括:
RNA(0.05～1μg总RNA) 11μL
Oligo(dT)15(10μmol/L) 1μL
共计12μL，混合液轻轻混匀离心后，于65℃保温5min，然后在冰上冷却2min。
(2)在上述离心管中添加配制反应混合液Ⅱ，其中包括:
5×第一链反应缓冲液 4μL
RNase Inhibitor(20mmol/L) 1μL
dNTPs(10mmol/L) 1μL
RNAase Inhibitor 1μL
反转录酶(200U/μL) 1μL
轻轻混匀并离心收集在管底后，然后加入到反应液Ⅰ的管底，并混匀，共计20μL，稍离心，在42℃条件下反应1h，取出在85℃中5min终止反应。放入－20℃冰箱中备用。
2.cDNA的PCR扩增:利用扁豆Cyclin G基因特异性引物进行cDNA的PCR扩增，反应体系为25μL，其中包含:
10×Taq Buffer 2.5μL
dNTPs(10mmol/L) 1μL
引物1(10μmol/L) 1μL
引物2(10μmol/L) 1μL
Taq 酶(2U/μL) 0.5μL
cDNA第一链反应产物 1μL
无菌双蒸水 补至25μL
轻轻混匀混合液并离心，置于PCR仪中，进行扩增反应:94℃预变性4min;接下来是30个循环，循环程序如下:94℃变性1min，42℃退火30s，72℃延伸1min;最后72℃延伸5min，温度降到4℃即完成扩增。扩增反应结束后，取10μL的反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测cDNA扩增质量。
实验需要约8h。
五、结果与分析
以cDNA为模板PCR原理与正常的PCR相同，产物应与一对特异引物之间的序列大小396bp相似。
六、注意事项
反转录反应物混合前要把RNA和引物混合后先变性成单链，并在冰上迅速冷却。
七、思考题
1.提取RNA或进行RNA有关的实验特别需要注意哪些事项?
2.反转录第一链合成时为什么先将PolyT与RNA在65℃保温5min?然后又在冰上冷却2min?
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