实验九 构建pET-GFP高效表达载体
一、实验目的
学习重组质粒载体的构建。
二、实验原理
质粒pET-28a上有单一酶切位点NcoⅠ和EcoRⅠ，通过双酶切，将质粒pET-28a线性化，经过电泳、切胶回收酶切大片段，作为载体备用。
质粒pMD-GFP上也有酶切位点NcoⅠ和EcoRⅠ，通过双酶切，将质粒pMD-GFP切
图3-7 重组质粒pET-GFP的构建过程
割成3个片段，通过电泳，切胶回收小片段（750bp），作为供体备用。
由于载体和供体经过相同的酶切后，产生相同的黏性末端，因此在T4DNA连接酶的作用下，重组DNA分子两端的黏性末端又共价结合，自身环化成一个重组的环形DNA分子。
通过酶切、连接、转化，产生重组子，构建出的pET-GFP质粒可以通过碱变性法提取出来，再经过酶切、测序、PCR、表达等多种方法得到验证。
三、器材和试剂
水浴锅、凝胶成像仪、微波炉、恒温培养箱、恒温振荡器、漩涡振荡器、台式高速离心机、微量移液器、移液器吸嘴、无菌1.5mL离心管、水平电泳槽、电泳仪、制胶槽、加样梳
质粒pET-28a、质粒pMD-GFP、限制性内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ及相应的缓冲液、T4DNA连接酶及相应的缓冲液、琼脂糖、1×TAE电泳缓冲液、6×DNA上样缓冲液、GoldViewTM核酸染料、DL2000DNA Marker，Lambda DNA/Eco130Ⅰ（StyⅠ）Marker、DNA片段回收试剂盒、质粒提取的相关试剂
四、操作步骤
1.酶切
按照下列体系进行酶切
无菌去离子水 7μL
10×酶切缓冲液 3μL
10×BSA 3μL
质粒pMD-GFP 15μL
限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ 各1μL
无菌去离子水 4μL
10×酶切缓冲液 2μL
10×BSA 2μL
质粒pET-28a 10μL
限制性内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ 各 1μL
样品混匀后，瞬时高速离心，37℃水浴2h以上
2.电泳
先取酶切反应液2μL电泳，观察酶切情况，若已酶切完全，则将酶切反应液全部上样电泳。
3.纯化DNA片段
切胶回收载体和供体DNA片段。参照实验三的操作步骤。
4.连接
按照下列体系连接
无菌去离子水 1μL
10×连接酶缓冲液 1μL
载体DNA片段 2μL
供体DNA片段 5μL
T4DNA连接酶 1μL
样品混匀后，瞬时高速离心，16℃反应1h以上。
5.转化
连接产物转化大肠杆菌DH10B。参照实验五的操作步骤。
6.重组子的筛选
（1）菌落PCR法 以转化平板上的单菌落为模板，以GFPf和GFPr为引物，进行PCR扩增，参照实验一中的操作步骤，电泳检测，若存在750bp左右的单一条带，则初步鉴定为重组转化子。
（2）测序法 从平板上挑取单菌落，接种于5mL LB液体培养基中（含卡那霉素），37℃，200r/min振荡培养过夜，取1mL菌液送测序公司测序。
（3）酶切法 从平板上挑取单菌落，接种，提取质粒后，酶切，参照实验八操作步骤，若单酶切后片段大于pET-28a的线性化片段，双酶切后有小片段（750bp）出现，则为重组转化子。
7.重组质粒载体的提取
挑取转化平板上的单菌落，接种于液体LB培养基（含卡那霉素）中，37℃，200r/min振荡培养过夜，取菌液提取质粒。参照实验七操作步骤。
五、参考文献
［1］ 〔美〕奥斯伯，等.精编分子生物学实验指南.4版.马学军，等译校.北京:科学出版社，2005.
［2］ 〔美〕J.萨姆布鲁克，等.分子克隆实验指南.3版.黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008.
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