表达载体的构建

基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物、动植物的遗传性状。

所谓表达载体（expression vector），是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅可使外源基因扩增，还可使其表达。原核生物和真核生物的表达载体有一些共同的要求，但两者的基因表达调控机制有很大不同。

当真核生物基因在原核细胞中表达时，表达产物有两种形式：一种是非融合蛋白，另一种是融合蛋白。两种形式各有利弊，在进行基因工程时可根据具体情况进行设计。

1.表达系统的要求与主要调控元件

真核细胞基因在原核细胞中表达将遇到一系列困难：真核生物的启动子不能被原核生物的RNA聚合酶所识别；真核生物细胞的mRNA上没有SD序列，因此不能被原核生物细胞核糖体结合；真核生物的基因含有内含子，原核细胞缺乏将它们的转录物进行拼接加工的机制；真核细胞的基因产物，往往需要翻译后加工，原核细胞缺乏有关的加工酶；真核生物基因表达的蛋白质易被原核细胞蛋白酶所降解，等等。

因此在用原核细胞表达真核生物基因时，应注意以下三个问题：① 基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的cDNA；② 基因必须置于原核细胞启动子、终止子和SD序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别；③ 产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。

表达系统的要求与主要调控元件包括：启动子、核糖体的结合位点、转录终止信号和密码子偏爱性等。

（1）启动子（promoter）

启动子是指RNA聚合酶结合于DNA并起始合成RNA的一段DNA控制序列。原核基因启动子位于转录起点（transcription initiation）上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。一个称为－10区，位于转录起点上游约10bp处；RNA聚合酶于该处解开DNA双链，并决定转录起点；另一个称为－35区，位于转录起点上游约35bp处，是RNA聚合酶识别并结合的位点。

目前在原核表达系统中使用最普遍的强型可调控的启动子主要有以下5种：① lac启动子，是乳糖操纵子的启动子，受lac Ⅰ编码的阻遏蛋白调节控制；② trp启动子，是色氨酸操纵子的启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调控；③ tac启动子，由lac启动子的－10区和trp启动子－35区融合而成，汇合了lac和trp两者的优点，是一个很强的启动子，同样受LacⅠ阻遏蛋白调控 。 ④ P（L、R）启动子，是λ噬菌体左、右向启动子，其温度敏感的阻遏蛋白受温度调控；⑤ T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多且十分专一，只被T7RNA聚合酶所识别。

（2）核糖体结合位点（ribosome-binding site）

原核微生物的mRNA结合核糖体的序列最初是由夏英（Shine）和达尔加诺（Dalgarmo）发现的，故称为SD序列。在大肠杆菌中，核糖体结合点包括起始密码子（AUG）及位于起始密码子上游3～11bp处，长度为3～9bp的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与核糖体小亚基上16SrRNA3′端一段富含嘧啶的保守序列互补，从而带动核糖体与mRNA的结合。不仅SD序列对翻译效率有明显影响，而且SD序列与起始密码子之间的序列和距离对翻译效率也有影响。

（3）转录终止子（terminator）

转录终止子指一段位于基因或操纵子的3′末端，具有终止转录功能的特定DNA序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。

（4）密码子的偏爱性

由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。在原核生物细胞中，对于tRNA丰富的密码子称为偏爱密码子（biased codons），而对应于tRNA稀少的密码子称为稀有密码子（rare codons）。

不同生物对各种密码子的使用频率不同，高等动植物中使用频率高的密码子可能在原核细胞中被用得很少。因此在基因工程中必须根据宿主生物偏爱密码子改造基因的编码序列，才能得到高效表达。

2.表达载体中调节开关的作用

通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中。这是由于某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长；此外，某些载体的启动子是强启动子，如T7启动子，强启动子的表达非常强以致使正常宿主基因不能表达。基于以上事实，宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两个阶段进行。第一阶段是使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至获得足够量的细胞。第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。

在原核基因表达调控中，阻遏蛋白-操纵基因系统起着重要调节开关的作用。当阻遏蛋白与操纵基因相结合时，能够阻止基因的转录。加入诱导物，使其与阻遏蛋白结合，又可解除阻遏，从而启动基因转录。

外源基因表达常采用化学物质诱导与温度诱导两种不同方法。

3.非融合蛋白的表达

所谓非融合蛋白是指外源蛋白不与宿主蛋白融合，使其自身单独表达。

（1）非融合蛋白表达载体（expression vector of unfused protein）

为了在原核细胞中表达非融合蛋白，可将带有起始密码子AUG的真核基因插入到合适的原核启动子和SD序列下游。经转录和翻译，就可在原核细胞中表达出非融合蛋白。

非融合蛋白的表达可直接产生天然的外源蛋白，但外源蛋白易被细菌细胞内的蛋白降解，造成表达产量低下。为了保护表达的真核蛋白免受降解，一般可采用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株作为表达外源蛋白的宿主菌；或利用胞内蛋白酶抑制剂使宿主菌蛋白酶受到抑制；此外，也可设法采用将外源蛋白分泌到胞外或形成包涵体等方法。

（2）外源蛋白的分泌表达

如果合成的外源蛋白能不断从细胞内分泌出来，不仅可免受宿主细胞中蛋白酶的降解，而且有利于提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。

分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。通常信号肽与外源蛋白的N端连接，由于信号肽含有带正电荷的氨基酸和疏水氨酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜上的信号肽酶将信号肽切除。

已知真核生物的分泌蛋白大多能在大肠杆菌中得到很好分泌，此外一些相对小分子的多肽也能较好分泌。对于表达的真核生物非分泌蛋白，即使装上信号肽也常不能被分泌到周质或外膜内，最多只能结合到细胞内膜上。

（3）包涵体（inclusion body）

当外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包涵体。利用大肠杆菌生产的非融合蛋白在多数情况下以包涵体形式存在。

形成包涵体有利于外源蛋白的高水平表达和防止蛋白酶对它的降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害。此外也有利于表达产物的分离。但包涵体形式的表达蛋白不具化学活性，而且影响负责N端加工的酶对表达蛋白的加工作用。因此，在经过差速离心得到包涵体后，通常必须对其进行变性和复性处理，以便得到具有正确构象和生物活性的蛋白质产品。

4.融合蛋白的表达

融合蛋白是指蛋白质的N端由宿主基因（通常只是N端的部分序列）编码，C端由外源基因编码的蛋白质，换言之，融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。

（1）融合蛋白的表达载体（expression vector of fused protein）

为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达载体中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致，翻译时才不会产生移码突变。通常，可构建一套表达载体，第一个载体有正常阅读框架，第二个载体多一对碱基，第三个载体多二对碱基。选择上述三种载体之一并与外源基因连接，以保证外源DNA阅读框架的正确性。

（2）表达融合蛋白的优点

融合蛋白较易获得高效表达。融合蛋白的N端总是选择天然的高表达的宿主蛋白质，其mRNA具有较强的翻译能力。融合蛋白在细胞内比较稳定。外源蛋白特别是相对相对分子质量较小的蛋白，通常在宿主细胞内极易被胞内蛋白酶所清除。但是如果外源蛋白与宿主的一个蛋白构成融合蛋白，就可保护外源蛋白不受宿主细胞降解。许多融合蛋白可用作抗原。

（3）融合蛋白中目的蛋白的分离纯化

从融合蛋白中分离出目的蛋白，目前采用两种方法：① 酶法。在细菌蛋白和真核蛋白之间加入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列。例如，Ile-Glu-Gly-Arg可被凝血因子Xa识别并在C端切开。 ② 化学法。在基因工程胰岛素生产中可在胰岛素与细菌蛋白之间加入甲硫氨酸，然后用CNBr切割融合蛋白，结果在甲硫氨酸处被专一切开，形成一条细菌蛋白和一条胰岛素链。