基因表达载体的构建有哪些步骤

第二节　基因工程

基因工程是生物工程的基础和核心，它是生命科学发展的一次飞跃，借助基因工程技术，使人们从认识生物、利用生物的时代，跨进了一个改造和创建新生物的伟大时代。基因工程是在DNA分子水平上进行的一种分子操作技术，使不同种属或不同个体的基因发生重组或发生基因结构的定向变化，以形成新的生物机体或新的生物功能，并获得新的遗传特性。基因工程可形象地比喻为用“剪刀＋糨糊”创造新物种的工程。基因工程的基本过程包括：

①从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因（人们所期望的外源基因）的DNA片段；

②将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子；

③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞内，使目的基因得以增殖和表达；

④筛选获得了重组DNA的受体细胞，进行克隆；

⑤克隆基因的表达，生产出人类所需要的物质。

一、目的基因的获取

要制备DNA重组所需要的目的基因，目前多采用以下途径：

（1）从基因组中直接分离　低等生物的基因组DNA比较简单，且有不少基因已知其准确定位，如乙肝病毒的基因组只有3kb，有X、S、C、P等基因，可从基因组中直接分离得到目的基因。对高等生物基因组DNA建立基因文库时，将基因组DNA作不完全酶解，经梯度离心或电泳回收适合于插入载体的DNA片段构建基因文库。

（2）合成cDNA　分离纯化编码某种蛋白质的mRNA后，在逆转录酶催化下合成其cDNA，将cDNA与载体重组。这多用于构建真核生物DNA文库来筛选目的基因。

（3）人工合成　编码某些生物活性肽的基因只有十几个或几十个核苷酸组成，可以通过人工合成这些基因。

（4）聚合酶链反应（PCR）扩增基因　PCR是一种在体外利用酶促反应扩增各种材料DNA的专门技术。通过扩增可在2～3h内将纳克甚至皮克级的DNA扩增至微克级，足以有效地进行DNA重组。

目前基因工程中主要是从生物基因组分离。一个DNA分子上有成千上万的基因，要将所需要的基因切割下来是很难的，早先曾用物理方法如流体切力、超声波等，这些方法切割的基因目的不明确，切下的DNA片段难以控制。自从20世纪70年代初发现了一类特殊的核酸内切酶——限制性核酸内切酶后，这一目的才得以实现。

1.限制性核酸内切酶：基因的剪刀

限制性内切核酸酶简称限制酶，是一类水解DNA的磷酸二酯键的酶。与以往发现的一些DNA水解酶相比，限制酶在碱基专一性及断裂DNA链的方式上都有一些特殊的性质。限制酶作用于双股DNA，能够识别DNA分子上特异核苷酸序列，造成双链切口，产生独特的DNA片段。由于它具有可控制、可预测的位点特异切割DNA的性质，从而成为在分子水平上解剖、绘制基因图谱、序列分析、克隆以及重新构建遗传信息的极其重要的工具。现在发现的限制酶主要来源于原核生物。

根据酶的结构、功能特性及所需辅因子的不同，将限制酶分为三种类型。其中第二类酶是基因工程中最常用的一类酶，这类酶在迄今发现的限制酶中占绝大多数；相对分子质量较小（＜100000），由相同亚基构成；对DNA不仅有专一识别序列，而且有恒定的切割位点，切割位点在识别序列内或邻近识别序列，仅需Mg^2＋为辅因子。

2.目的基因获取的方法

用限制酶或其他方法将DNA切割后，还须将带有目的基因的片段分离出来，常采用下列几种方法：

（1）DNA片段的直接提取　用于基因工程的DNA分子经过限制酶处理后，切成大小不等的片段，从这些片段中分离出所需要的带有目的基因的片段，可采用一般制备DNA的方法，如凝胶过滤、离子交换或纤维素色谱法以及密度梯度离心等。用这种方法提取的DNA片段，其大小变化较大，在提取过程中也有被破坏的危险。由于全部DNA片段都被提取，须经过大量筛选工作方能得到目的基因，因此盲目性大。但由于此法简单，并不需要繁杂的操作技术，故也常采用。对于所需基因的分离和筛选一般可用与该基因有关的放射性mRNA作指示，因为这种基因与有关的mRNA是互补的，可以形成带放射性的杂合分子，这样即可检验被分离基因的真实性。

（2）用噬菌体（phage）或质粒（plasmid）直接从宿主细胞中将目的基因携出　有些噬菌体能在宿主染色体的特定位置插入，在它离开染色体时，可将与之连锁的基因一起带出；有些噬菌体在比较广泛的位置插入，则可带出更多的基因。例如，大肠杆菌乳糖操纵子的制备，曾采用两种特定的噬菌体，它们所携带的乳糖操纵子方向相反（一个噬菌体接于调节基因一边，另一个接于结构基因一边），当将来自两噬菌体带有正反基因的两条单链（将其变性后得到）进行退火时，操纵子部分可以重新形成双链，而其他部分仍然是松散的单链，再用单链核酸酶将单链部分切除后，留下的即是乳糖操纵子部分。

许多质粒也有整合到宿主染色体上的特性，在重新游离于染色体外时，有时也会带上一些基因，将所需基因带出。用以上方法取得基因，只能取得噬菌体或质粒能插入的位点附近的基因，并且必须获得特异的噬菌体或质粒才行。由于某些质粒整合到染色体上的频率很低，携带基因的频率必然也低，因此这种方法的局限性较大。

（3）使用相应的mRNA分离基因　利用酶法或化学法人工合成的mRNA，或从细胞中提取的mRNA，通过反转录酶的作用，即可合成相应的染色体DNA基因片段；或者用人工合成的mRNA作探针，去“找寻”与之相应的染色体基因。

这种方法尤其适用于一些单拷贝基因，例如珠蛋白基因。

二、基因载体

为了使目的基因在受体细胞中增殖表达，一般需要适当的运载工具将其带人细胞内并携带着目的基因一起进行复制与表达。这种运载工具就称为载体。在基因工程操作中对载体的要求是：①必须具有少数（1～2个）限制性内切酶位点；②便于进行分子克隆；③有可供选择的标记（如耐药性），从而易于鉴定和筛选；④可以在受体细胞中独立地进行复制，当连接了异源DNA后也不失去自我增殖的能力；⑤拷贝数多，容易分离。基因工程中常用的载体有细菌质粒、噬菌体或病毒。

1.质粒

质粒是细菌染色体以外的能够进行独立复制的遗传单元，为双股环状DNA，其分子中含有1000～20000个碱基，它们的复制有的受染色体复制的严格控制，称为严谨型控制质粒；有的自行复制时并不受染色体复制的严格控制，称为松弛型控制质粒。基因工程中常用后一类质粒作为载体。质粒在细菌内所表达的性状，有耐药性、决定性性状、产抗生素、产溶血素、产毒素、产细菌素、抗金属离子、分解芳香族化合物等，选作基因载体时，选那些表型性状清楚、容易鉴别的质粒。常用的载体选择具耐药性和产生细菌素的质粒或将其改造后的衍生质粒，如pSC101、Col　E1、pMB9、pBR3X等。

pSC101质粒是大肠杆菌R6-5质粒经机械切割后，产生的一个小质粒，这个质粒带有四环素抗性基因及复制区域，其大小只有R6-5的1/10。pSC101具有一个EcoRⅠ切点及一个HindⅢ切点，外源DNA的插入不影响其对四环素的抗性，也不影响质粒的复制。

2.噬茵体或病毒

以噬菌体或病毒作为载体，将所需基因或含有此基因的DNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。病毒的转导作用常常用于基因工程。在基因工程中常用作载体的噬菌体有x噬菌体及其衍生物、柯斯质粒及M13单链噬菌体等，以及感染真核生物的病毒SV40等。

三、DNA重组的步骤

实现DNA重组的步骤分为转化、筛选和表达。

1.转化

获得目的基因后，首先应将它与基因载体DNA连接，形成重组体。其连接的方法有几种不同情况：用同一种限制酶处理供体细胞的染色体和基因载体，其切口处如果是黏性末端，则带有目的基因的DNA片段可以同载体的切口“粘接”起来，再通过DNA连接酶连接，形成重组体；如果切口处形成的是平端，DNA连接酶也可连接，但效率很低（只有黏性末端的1%）；或者用末端核苷酸转移酶催化，分别在载体切口和外源DNA片段一条链的3＇-OH末端添加寡聚T（或寡聚C），在另一链的3＇-OH末端添加寡聚A（或寡聚C），这样用人为的方法形成黏性末端，便于形成重组体。形成重组体后，需将重组体引入受体细胞。外源DNA引入受体细胞并使它获得新遗传特性的过程称为转化，也就是将重组体引入细胞的过程。这种转化过程的成功与否，取决于两个条件：

第一，受体细胞是否处于感受态。所谓感受态就是容易吸收外源DNA的状态。虽然许多细菌细胞和真核细胞能够吸收外源DNA，但其频率很低，约为10^-6。为了使受体细胞处于感受态，现在一般使用0.01～0.05mol/L cacl2处理，可以使外源DNA，比较容易进入大肠杆菌、枯草杆菌等，这可能与Ca₂＋改变了这些细菌细胞膜的通透性有关；另一个方法是用酶或化学试剂处理，以破坏细菌的细胞壁，形成原生质球，再用氯化钙处理，外源DNA就容易被吸收。

第二，引入的重组DNA必须避免受体细胞核酸酶的降解。因此，选择受体菌株最好用核酸酶缺陷菌株。

2.筛选

在众多细菌的群体培养中，从中筛选出已转化（或转导）并含有目的基因的重组体，这是一个十分关键而难度大的工作，目前多种技术或手段方法已成功应用于筛选含有目的基因的重组体，包括遗传学方法、分子杂交法、免疫学方法。

（1）遗传学方法　在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常都是经过加工改造的衍生载体，它们要么带有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能。例如，质粒载体具有耐药性或营养标记，噬菌体载体形成噬菌斑的能力或特征有所变化。这就使带有目的基因与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。

（2）放射性探针检测法　利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来检测有外源DNA插入的重组体，是一种快速而灵敏的方法。有两种杂交法：一是利用放射性RNA作探针，二是形成R环。放射性探针检测法是将转化菌铺放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜上，再进行培养；然后取出长有菌落的硝酸纤维素滤膜，用碱溶液处理，使菌落破裂，并使DNA变性。因为变性DNA同硝酸纤维素滤膜有很强的亲和力，便留在滤膜上，在80℃下烘烤滤膜，DNA就牢固地固定在滤膜上。再用放射性同位素标记的RNA（或DNA）同滤膜上的菌落杂交。经过一段时间后，用含有一定离子强度的溶液将非专一性结合的、仅仅是吸附在膜上的放射性物质洗去，烘干滤膜，进行放射自显影。凡是含有与放射性探针互补序列的菌落，就会在X射线胶片上出现曝光点，即代表杂交上的菌落，再按底片上菌落的位置找出培养基上相应的菌落。如果需要，将它扩大培养后，再作进一步分析。

（3）免疫测定法　只要一个克隆的目的基因能够在宿主细胞中表达，合成出外源蛋白质，就可用免疫测定进行检测。免疫测定法分为放射性抗体测定法和免疫沉淀测定法。放射性抗体测定法是将在固体培养基上由菌落所产生的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，再用相应的带有放射性标记（如125I）的抗体进行反应，洗去非特异性吸附的放射性物质后，用放射自显影显示结果。免疫沉淀测定法是用一种特异抗体与外源基因表达产物蛋白质，在固体培养基上发生抗体一抗原沉淀反应，根据沉淀物所产生的白色沉淀圈来加以检测。

免疫法测定只能是所转移外源DNA必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。但从基因工程的最终目的而言，免疫测定是其他任何检测方法所不能取代的。

3.表达

带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。因为基因表达是在一定调节控制下进行的，外源基因在受体细胞中能表达，必须满足一定的条件，特别是真核基因在细菌中的表达。比如，真核基因表达的启动子能不能被原核细胞RNA聚合酶识别而进行转录？真核基因转录出的mRNA是否具有核糖体结合位点，使翻译能顺利进行？翻译产生的蛋白质能否通过细胞膜而排出细胞？外源蛋白是否会被受体细胞中的蛋白酶降解而失活？总之，基因工程要达到最后目的取得功能蛋白，必须依赖于目的基因的有效转录和mRNA正确的翻译及翻译后加工，如果这些环节中任何一个环节不能正确地进行，均可导致基因工程的失败。对于上述问题，在基因工程中目前已采取了一些措施，使得某些基因得以正确表达。在转录上，在克隆的目的基因上游接一个原核细胞的启动子，这样原核细胞的启动子作为一种强启动子就可以启动真核基因在原核细胞中表达。在翻译上，大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点是起始密码子（AUG和GUG）和SD序列（一段同核糖体1 6sRNA3＇末端互补的特异序列），这在真核基因转录产物mRNA上是没有的，为了有效地翻译真核细胞蛋白，现在多应用载体上的核糖体结合位点。此外，目的基因插入的方向必须与载体DNA方向一致，并要保持目的基因的翻译相位不产生错位，保持原有的阅读框架。为了避免目的基因表达产物蛋白质被受体细胞蛋白酶降解，现在一般采用合成融合蛋白的方法。所谓融合蛋白是指它的氨基端是原核细胞序列，羧基端是真核细胞序列。因为在细菌中真核基因表达的融合蛋白比非融合蛋白稳定，不容易被细菌蛋白酶降解。困此，将真核基因引入原核细胞表达时，通常在真核基因的上游接一段原核基因，接一段信号顺序，以便合成产物能分泌到细胞外，另外接一个原核基因表达的启动子，这样，真核基因就便于在原核细胞中表达，合成出所需要的功能蛋白质。