无菌生理盐水中的无菌理论

任务5.2　理论基础

自然条件下，微生物常常呈群落存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。例如，一小块土粒中就可能含有各种微生物。为了研究某种微生物的特性或更大量培养和利用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群中获得纯培养，即从自然界或混有杂菌的培养物中将所需的微生物提纯出来。微生物学中把从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养是研究和利用微生物的前提和基础。获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。常用的方法有固体培养基分离、液体培养基分离、单细胞分离、选择培养、富集培养以及二元培养等。

5.2.1　固体培养基分离纯培养方法

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落（colony）。形成的菌落便于移植。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。

大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板（cultureplate）的简称，它是指融化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。固体培养基是用琼脂、明胶或其他凝胶物质固化的培养基。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离纯培养的技术简便易行，一百多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。

1）稀释平板分离法

首先将待分离的材料用无菌水或无菌生理盐水作一系列的梯度稀释（如1:10，1:100，1:1000，1:10000，…），制成均匀一致的一系列不同稀释度的稀释液，尽可能使菌落呈单个细胞或孢子存在（否则一个菌落就不只是代表一个菌）。然后分别取一定量的不同稀释度的稀释液滴入灭过菌的培养皿中，倾入已融化并冷却至45～50℃左右的琼脂培养基，让其与稀释液混合，摇匀后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可能出现分散的单个菌落。如果稀释得当，在培养基上会出现分散的单个菌落，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。随后挑取该单个菌落，重复以上操作数次，接种新鲜培养基便可得到纯培养。

（1）稀释液的制备

将样品进行10倍系列稀释。准确称取待分离材料10g或10mL，放入装有90mL无菌水（或无菌生理盐水）并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，充分摇匀20min，使微生物细胞分散，静置约20～30min，制成1:10即成10^－1倍稀释液。再用1mL无菌吸管，吸取1:10的稀释液1mL移入另一只装有9mL无菌水（或无菌生理盐水）的试管中，同样让菌液混合均匀，制成1:100即成10^－2稀释液，再换一支无菌吸管吸取10^－2菌液1mL，移入另一个装有9mL无菌水（或无菌生理盐水）试管中，制成1:1000即成10^－3稀释液。按此法依次稀释至所需要的浓度。注意，每递增稀释1次，即应更换1支无菌吸管，否则稀释不准确；在将菌液注入无菌水或无菌生理盐水中时，吸管尖不能碰到液面。

（2）混菌法接种分离

用无菌吸管按无菌操作过程吸取适宜稀释度的菌悬液1mL，注入无菌培养皿中，然后根据分离目的不同，倾注已融化并冷却至45～50℃的选择性培养基15～20mL。轻轻转动培养皿将菌液与培养基混匀，待凝固后放入恒温培养箱培养，直到培养皿上形成肉眼可见的细胞群体——菌落（图5.4）。

图5.4　稀释分离法示意图

（3）涂抹法接种分离

采用混菌法将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，也会使一些专性好氧菌因被固定在培养基中缺乏氧气而影响其生长，因此更常用的分离纯培养物的方法是涂布平板法。其做法是先将已融化的培养基15～20mL倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，用无菌吸管按无菌操作过程吸取适宜稀释度的菌悬液0.1 mL，滴加至平板表面上，然后用无菌玻璃涂布棒将菌液涂匀至整个平板后培养，直至培养皿上形成肉眼可见的单菌落。

2）稀释摇管法

用固体培养基分离厌氧菌时有特殊要求。如果该微生物为耐氧菌，可以用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，可采用化学、物理或生物的方法清除容器中的氧气。但对于那些对氧气更为敏感的厌氧微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法，它是稀释平板法的一种变通形式。稀释摇管法的具体操作是：先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂融化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开，在适宜条件下培养后，可能在琼脂柱的中间形成单菌落。挑取和移植单菌落时，需先用一支灭菌接种针将液体石蜡——石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察或菌落的移植。

3）平板划线分离法

平板划线分离法和稀释平板分离法的原理是相似的，此法是在固体培养基上通过划线的方法，使接种到培养基表面的菌体数逐渐减少，起到菌数“稀释”的作用，以达到分离出理想的单个菌落的目的。划线法简单，速度较快，但分离单细胞的几率较平板法低。

操作时用接种环以无菌操作沾取少许待分离的样品，在无菌固体平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少。通过划线将混杂的菌体在平板表面分散，如果划线适宜的话，微生物能一一分散开，经培养后，可在固体平坂表面得到单菌落。根据菌落形态特征挑取单个菌落，移种培养后，即得到纯培养。

此法适于含菌比较单一样品的纯化。若样品不单一，可进行“挑菌纯化”，即在固体平板上选择分离较好的有代表性的单菌落，接种到斜面并同时做涂片检查。若有不纯，应进一步挑取此菌落划线分离，或制成菌悬液作稀释分离，直至获得纯培养。

平板划线分离法有以下几种，可根据不同情况选取。

（1）平行划线法

此法适用于含菌不多的液体样品，如分泌物等。操作时左手斜持平板底，右手持接种环。接种环通过酒精灯火焰灭菌、冷却后，沾取一接种环样品液，先在平板表面靠近皿边的一端涂抹开，涂成约如一角硬币大小的一块面积，然后用接种环从涂抹处开始向下连续弯曲划密集的平行线，形似“Z”字，划至大约平板面积的一半左右。将平板转180°角，从平板另一端开始也划密集的平行线，直到划满平板的剩余部分。盖好皿盖，接种环火焰灭菌后放回原处，将平板倒置于37℃恒温箱培养，供分离成纯培养。操作时注意不可划破培养基表面，线条尽可能相互靠紧，如偶然稍有重叠也不妨碍。一般来说，一个平板应划50条线以上（图5.5）。

（2）分区划线法

此法适用于含菌多的样品，如细菌固体培养物、粪便等。划线前的操作同平行划线法。将平板划分为3～4个区域，先在平板表面靠近皿边的一端将样品涂开并在平板的1/5～1/4面积上连续划密集的平行线，接种环火焰灭菌。将平板转约70°角，待接种环冷却后，使接种环通过已划线的1区末端平行划线5～7次，以后即不与1区接触作连续密集划线，约占平板面积的1/4，接种环再通过火焰灭菌。再转平板约70°角，如上法在第3区划线，此后接种环不再灭菌。重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表面。盖好皿盖，接种环灭菌后放回原处，将平板倒置于37℃恒温箱培养。培养后在第1、2区可观察到密集的细胞菌苔。在第3、4区可见单个菌落（在划线上）（图5.6）。

图5.5　平行划线法示意图

图5.6　分区划线法示意图

或者，划线可以略稀一些，每皿少划几条但接种环不经灭菌，一直连续划三皿，这样做要多划培养基，效果有时更好。

4）选择培养分离

在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落都是由多种微生物组成的。因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，单采用一般的平板稀释分离法、划线分离法几乎不可能分离到特定微生物。例如，若某处的土壤中的微生物数量在10⁸时，必须稀释到10^－6才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需要的微生物的数量仅为10²～10³，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其他被抑制。这种通过选择培养进行微生物纯培养的技术称为选择培养分离。

（1）利用选择培养基进行直接分离

如果某种微生物的生长需要是已知的，就可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，即使在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰。再如，要分离高温菌，可在高温条件下培养；要分离某种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、黏细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使菌体本身和其他不能够移动的微生物分开，可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。

（2）富集培养

主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物，这种方法称为富集培养。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH值、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。例如，采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物试验过程。首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基并分装于三角瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。取上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后，能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高。将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释平板分离或平板划线等操作得到纯培养。

富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。

5）二元培养

分离的目的通常是要得到纯培养，然而在有些情况下是做不到的或是很难做到的，但可用二元培养物作为纯培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有两种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有两种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物则称为二元培养物。例如，二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其他生物的细胞内寄生物，或两者有特殊的共生关系，如银耳与香灰菌丝的共培养物等。二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实硷室培养。培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成，例如，纤毛虫、变形虫和黏菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。

5.2.2　用液体培养基分离纯培养

对于大多数细菌和真菌，用固体培养基分离法分离都可以获得满意的纯培养物，这是因为大多数种类的微生物在固体培养基上生长良好。然而并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如，一些细胞较大的微生物，许多原生动物和藻类等，仍需用液体培养基分离来获得纯培养。

1）稀释法

通常采用的液体培养基分离方法是稀释法。即将待分离的样品接种到液体培养基中，经培养后得到混合培养物，将混合培养物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，尽可能使一支试管中只含有一个微生物。如果经稀释后，在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数试管（一般应超过95%）中有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物；如果经稀释后，同一个稀释度的许多平行试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的可能会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

2）单细胞分离法

稀释平板分离法只能分离出混杂微生物群体中数量占优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时可以采取显微分离法和专门的分离小室从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减少手的动作幅度，在显微镜下用毛细管夹或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。单细胞分离法可以保证一个菌株由一个细胞发育而来，能达到“细胞纯”的水平。

（1）细菌的单细胞分离

进行细菌单细胞分离时，最可靠的方法是利用显微操作仪在显微镜下操作，将一个细菌细胞移植到培养基上培养。但是显微操作仪价值昂贵，使用复杂，故在一般实验工作中（如诱变育种工作）多用机械作用使细菌充分分散后作稀释分离，则所得菌落大多是由单细胞发育而来。具体做法如下：

将含菌样品以无菌操作挑取少许，放入盛有20～30mL无菌水并放有玻璃珠的100mL三角瓶内，在振荡器上振摇30min，使所含细菌充分分散。然后将此悬浮液通过底部垫有脱脂棉并事先灭过菌的漏斗，滴入另一无菌的100mL三角瓶中。凡成团的未打散的细菌细胞在过滤时将被滤除，故滤液中的细胞大多数是单个的。这时将滤液按普通稀释法作平板分离，即可获得单细胞发育的菌株。

（2）真菌的单孢子分离

对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜下进行。具体方法有如下几种：

方法一：将直径2mm的软玻管在酒精灯上拉成很细的毛细管，一端稍粗，弯成准确的直角，酒精消毒后，粘于显微镜集光器的聚光透镜上面，毛细管口朝上。此时应将集光器旋下，并使毛细管尖端位于通光孔的正下方。

将欲分离的孢子用无菌水做成适宜稀释度的悬浮液，滴一小滴于灭菌载玻片上，反转放在载物台中央，使水滴位于通光孔中央，成为悬滴。

用低倍镜检查，找到悬滴中的单个孢子，此时旋上集光器，渐渐在视野中可看到毛细管口。移动玻片使毛细管口对准所见的单个孢子，再稍旋上集光器，让管口接触孢子。由于毛细管作用，孢子被吸入毛细管内，取下毛细管，将管内小水滴移于新鲜培养基上培养。

方法二：此法适宜于分离较大的真菌孢子。取经卵白法澄清了的琼脂培养基倒入培养皿制成平板，冷凝后翻转培养皿，用特种蜡笔在皿底平行划线若干条，再将皿转回正面向上置于桌上。用接种环圈取适当稀释度的孢子悬浮液在平板上沿蜡笔线划线“接种”。再翻转培养皿在低倍显微镜下沿划线检视，发现单个孢子便用蜡笔划一小圈，把孢子划在圈内。然后用较粗的接种针，事先尖端捶扁，折成一圈，成一接种勺（图5.7）。用接种勺把划了圈部分的培养基（上面有一孢子）切下，移到新鲜琼脂培养基平板上培养（同时还应再检视一下切去培养基的部分原来所见的那个孢子是否确已移去）。以后移接部分长出的菌落便是由圈取的那个单孢子发育而来，可移至斜面保存。

图5.7　接种勺

方法三：此法适宜于分离伞菌的单孢子。将菌帽覆盖于无菌载玻片上放置一定时间，待多数孢子自菌褶散落后，用灭菌针在显微镜下黏附孢子，移于培养基上培养。

5.2.3　微生物育种方法

微生物作为生物大家族中的特殊类群，由于种类多、数量大、分布广、代谢活力强、产物类型多、繁殖迅速、适应性强、容易变异等特点，长期以来备受科学工作者和企业家的关注。微生物种类之多，难以估测。随着微生物学研究工作的不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。在微生物研究、生产、应用中，“种”的重要性尤为突出，菌种的好坏，影响到产品的数量和质量。因此，挑选符合生产要求的菌种，改良已有菌种的性能，使产品的质量不断提高，并能适应于工艺改革，这是菌种选育工作的任务。

菌种选育主要是应用微生物遗传和变异的理论，在已经变异的微生物群体中筛选出符合人们需要的优良菌种。菌种选育的目的主要是改进品种质量，创造新品种，提高单位产量。菌种选育包括选种和育种两个方面，这两者既有联系又有区别。选种是指经过比较鉴定自然界的微生物，从中分离和筛选出某种性能较强的、符合生产要求的菌种。选种是菌种选育的前提条件，它包括从自然界中获得新菌种。育种是指采用自然或人工的方法，促使微生物变异以改造菌种。育种在选育工作中占据主导地位，它包括诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种及基因工程。

1）菌种选育的理论基础

微生物菌种选育的理论基础是微生物遗传学和分子生物学。遗传和变异现象是生物的最基本特性，所谓遗传是亲代和子代生物学特性的传递过程，亲代的特性在子代中进行重现。所谓变异是子代的某些特性如形态、代谢等与亲代的差异明显。也即遗传是相对的，变异是绝对的。

微生物的变异性一般可分为遗传型变异和表型变异，在遗传物质水平上发生了改变从而引起某些相应性状发生改变的，称为遗传型变异。所谓表型变异是指微生物在生活条件发生改变时，发生暂时的形态、生理等特性的改变，但随着环境条件的复原，它们又恢复了原有的特性。如赤霉素产生菌，在见光条件下培养时呈橘红色，在黑暗条件下培养时则呈白色，当把白色的菌丝接种在新鲜的培养基上，放回到见光处培养时，则又出现橘红色，因为这种变异没有使遗传物质发生任何变化，而仅是表型的改变，所以是不可遗传的变异。我们主要研究的是遗传型变异，引起这种变异的途径有两种，即基因突变和基因重组。

（1）基因突变

突变是指遗传物质（DNA或RNA）中的核苷酸顺序突然发生了稳定的可遗传的变化。突变主要包括基因突变（又称点突变）和染色体畸变两大类。基因突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变引起的，而染色体畸变是指DNA大段变化（损伤）现象。

（2）基因重组

基因重组是指两个不同性状个体的遗传基因转移到一个个体细胞内，并经过基因的重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体的方式。重组分体内重组和体外重组两种。体内重组又分为DNA转化、噬菌体转导、体细胞接合和原生质体融合等方法。体外重组是以离体质粒DNA或噬菌体作外源DNA的载体，或运载DNA脂质体在细胞外进行基因重组，然后，通过转化或转染使这些载体进入受体细胞或原生质体内。当重组DNA进入受体细胞后，可独立地进行复制，或者插入宿主DNA中随宿主DNA一起进行复制，扩增有益基因，增加产物的产量或产生新物质。

2）微生物育种方法

自然选育、人工诱变、杂交育种、原生质融合等，尤其是诱变育种，在微生物菌种选育中发挥着重要作用，仍是目前重要的菌种选育手段。传统的微生物遗传育种是以微生物遗传变异的基本理论为基础进行的。从20世纪50年代以来，人们对遗传物质的结构与功能、遗传物质在细胞内存在的形式、遗传物质在细胞间转移的方式，以及遗传变异的本质等问题的研究逐渐深入，促进了微生物育种工作的发展。获得优良的微生物菌株，主要有以下两个途径：一是通过从不同生态环境中取样进行菌株分离和筛选，从广阔的自然界中获得新的菌种，即自然选育。二是对已有菌种进行遗传诱变，从中筛选获得具有优良性状的菌株。

（1）自然选育

不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。自然突变的发生是偶然的，即在任何时间，任何一个基因都可能发生突变。自然突变实际上就是由众多因素低剂量和长期综合诱变的结果。一般认为引起自然突变的原因有两种，即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量的诱变效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。例如胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。平衡是倾向于酮式或氨基式的，因此DNA双链中以AT和GC碱基配对为主。但在偶然的情况下，当T以烯醇式出现时的一瞬间，DNA链正好合成到这一位置上，与T配对的就不是A，而是G；若C以亚氨基式出现时的一瞬间，新合成的DNA链这一位置上，与C配对的就不是G，而是A。在DNA复制过程中发生的这种错误配对，就有可能引起自然突变。据统计，这种碱基对错误配对引起自然突变的几率为10^－9～10^－8。

自然突变可能会产生两种截然不同的结果：一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。在工业生产上，由于各种因素的影响，自然突变是经常发生的，也造成了生产水平的波动，所以技术人员很注意从高生产水平的批次中，分离高生产能力的菌种再用于生产。自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。但是自然选育的效率低，因此经常与诱变选育交替使用，以提高育种效率。自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。

自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的突变株。因此，它能达到纯化、复壮菌种、稳定生产的目的。自然选育有时也可用来选育高产量突变株，但这种正突变的几率很低，通常难以依赖自然选育来获得高产突变株。

自然选育一般包括采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等几个步骤。

①采样。采样即采集样品，是从自然界筛选菌种的第一步。微生物广泛分布在自然界中，土壤中、水中、空气中以及动植物体内外都有它们的存在。它们都是混杂群居的，但是其分布也有一定规律，因此，要从自然界找到所需要的菌种，就要根据菌种的特性和分布规律去采集样品。采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体的分析来决定。如要筛选分解纤维素的微生物，可到含纤维素较多的枯枝烂叶、腐烂的稻草或树木以及动物的消化道和排泄物等处采集；要筛选分解蛋白质能力强的微生物则可到皮革加工厂或炼乳场等有关材料或土壤中采集。一般来说，除某些特殊的菌种需在水中或空气中取样，或者在动植物体取样分离外，绝大多数微生物菌种均可从土壤中取样分离。因为土壤中含有丰富的营养，温度和其他自然环境比较稳定，且含有一定的水分，具备了微生物生存所需要的生活条件，所以土壤是微生物居住的大本营，包含的种类和数量都很多，是筛选菌种的主要来源。但不同的土壤，其中占优势的微生物种类也不同。例如，南方的土壤，因其有机质数量较多，所以筛选产生抗生素的放线菌多从南方土壤取样。

采样地点不同，采样的方法也不同。以土壤为例，选好地点后，用无菌刮铲或土样采集器取离地面5～15cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等。一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌的孢子忍耐不良环境的能力较强，不太容易死亡。但是，由于采样后的环境条件与天然条件有着不同程度的差异，因此采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。

②增殖培养。收集到的样品，如含所需菌种较多，可直接进行分离。如果样品含所需菌种较少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖（富集）培养。所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件，以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离。

增殖培养可以通过配制选择性培养基或设定一定的培养条件得以实现。例如，筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能生长；筛选脂肪酶产生菌时，以植物油作为唯一碳源进行增殖培养，能更快、更准确地将脂肪酶产生菌分离出来。除碳源外，微生物对氮源、维生素及金属离子的要求也不同，适当地控制这些营养条件有利于实现分离效果。另外，控制增殖培养基的pH值和温度，也是提高分离效率的一条好途径。

③纯种分离。通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态，还不能得到微生物的纯种，所以有必要进行分离纯化，获得纯种。要使所需要的微生物菌株从其他微生物中分离出来，就要根据该种微生物的特性，从分离的方法、培养基的选择、培养条件的控制等措施着手，才能获得预期效果。常用的分离方法有稀释法、划线分离法和组织分离法。

稀释法是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最低限度，取一定量稀释液注入平板，使微生物在平板培养基上形成单菌落，然后从中选择所需要的菌落接种到斜面上，再进一步纯化。为了得到单菌落，必须使平板上的菌落数不多不少，这就要选择一个适宜的稀释倍数，否则，稀释倍数过大，则稀释液中所含菌数过少，使所需要的菌种漏筛，没有长出来；稀释倍数过小，则菌落数太多不能达到分离的目的。一般来说，土壤中细菌含量最多，需用较大的稀释倍数，霉菌和放线菌次之，酵母菌最少。

划线分离法是用接种环或接种针挑取样品，在固体培养基表面进行有规则的划线，沿着划线的方向菌样逐渐被稀释，最后经培养将会得到单菌落。划线时必须注意无菌操作。

组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养基上，于适宜温度培养数天后，可见微生物向组织块周围扩展生长。经菌落特征和细胞特征观察确认后，即可由菌落边缘挑取部分菌种移接到斜面培养基上再进行培养。

稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的几率大，特别适合于分离具有蔓延生长的微生物，而划线法较简单快速。为了提高筛选工作效率，在增殖培养过程中，还应注意培养基的选择和培养条件的控制等方面。

微生物的种类不同，对营养物质的要求也不同。在某一特定类型的培养基上，有些微生物不能生长或生长微弱，这便可以利用不同类型的培养基来分离不同的微生物。如固氮菌能利用空气中的氮素，因此，可用无氮培养基来分离固氮菌，而其他微生物因不能利用气态氮而不能在无氮培养基上生长，这就体现了培养基的选择对于纯种分离的必要性。除此之外，还要注意不同微生物其生理特性也不同，根据其生理特性控制培养条件可以提高分离、筛选的效率。如细菌和放线菌一般要求偏碱性的培养基，酵母菌一般要求偏酸性的培养基。再如，一般培养细菌最适宜温度为37℃，而真菌一般最适宜温度为28℃。所以结合营养并调节不同的环境条件，可排除一些不必要的微生物。

④生产性能和毒性测定。分离纯化得到的纯种是否能达到目标菌的要求，是否能用于生产，还要进行性能测定。由于分离得到的菌株数量非常大，如果对每一菌株都作全面或准确的性能测定，则工作量巨大，而且是不必要的，因此可适当简化。一般采用两步法，即初筛和复筛。

初筛一般是定性测定，目的就是去掉不符合要求的大部分菌株，把与生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不至于漏掉。而复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛一般是定量测定。经过多次重复筛选，直至获得1～3株较好的菌株，作为生产用菌种。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株。

自然界的一些微生物在一定条件下将会产生毒素，为了保证食品的安全性，凡是与食品工业有关的菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。

除了从自然界直接筛选菌种外，还可进行定向培育从而获得优良菌株。定向培育是指用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因工程技术相比，定向培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外，一般要相当长的时间。由于这类育种费时费力，工作被动，加之效果又很难预测，因此早已被各种现代育种技术所取代。

（2）诱变育种

从自然界直接分离得到的菌种，往往还不完全符合工业生产的要求，如产量低、副产物多、生长周期长等，因而对菌种的要求不能仅停留在“选”种上，还要进行“育”种，根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。人为地利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物群体，提高突变几率，扩大变异幅度，从中选出符合育种目的的突变菌株的方法就是诱变育种。

诱变育种的基本环节是用合适的诱变剂处理大量而分散的微生物悬液，或处理生长在固体培养基上的菌体，以引起绝大多数细胞死亡，并提高存活个体的变异频率，然后淘汰负变菌株，把正变菌株中少数变异幅度最大的优良菌株挑选出来。诱变育种不仅可提高菌种的生产能力，而且还可以改进产品质量，简化生产工艺。从方法来讲，它具有速度快、收效显著等优点，因此，科学试验和生产上都广泛利用。

诱变育种整个流程主要包括诱变过程和筛选过程，基本步骤包括：出发菌株的选择，诱变菌株的培养，诱变菌悬液的制备，诱变处理，后培养，突变株的分离与筛选等。诱变流程如图5.8。

图5.8　诱变育种工作流程图

首先是诱变过程，具体步骤如下：

①出发菌株的选择。

用于进行诱变试验的菌株叫做出发菌株。诱变育种的目的是提高代谢最终产物或中间产物的产量，改进质量或改变原有代谢途径，产生新的代谢产物。选好出发菌株对提高诱变效果有着极其重要的意义。用作诱变育种的出发菌株常有以下几类：

第一类是从自然界分离的野生型菌株。这类菌株的特点是对诱变因素敏感，容易发生变异，而且容易向好的方向变异，即产生正突变。

第二类是在生产中经历生产条件考验的菌株。这类菌往往是经自发突变而筛选得到的菌株，从细胞内的酶系统和染色体DNA的完整性上看类似于野生型菌株，产生正突变的可能性大。另一方面，由于出发菌株已经是生产菌株，对发酵设备、工艺条件等已具备了很好的针对性，经过诱变育种所获得的正突变株易于推广到工业生产。

第三类是已经过诱变甚至是多次诱变改造过的菌株。这类菌株在育种工作中经常采用。对于这类菌株，由于情况比较复杂，必须区别情况，分别对待。一般的看法是原来为高产型的菌株，经过再诱变，容易产生负突变，即向差的方向变异，这种菌株要继续提高就比较困难，获得高产突变株的难度较大。相比之下，产量较低的野生型菌株容易提高产量，所以有人认为产量最高的菌株不一定是继续提高产量潜力最大的菌株。当然，高产原菌株的育种工作也应当做，如果采用针对性的育种方法能改变其遗传保守性，一旦获得正突变菌株，则对于提高生产效率和降低成本，效果将非常显著。一般认为最合理的做法是在每次诱变处理后选出3～5个较高产菌株作为出发菌株，继续诱变。如果是产量特别高的菌株，可先行重组育种，再作为诱变的出发菌株，就有可能得到好的效果。

选择出发菌株时应注意以下几个条件：

第一、出发菌株最好是单倍体的单核细胞。单倍体细胞中只有一个基因组，单核细胞中只有一个细胞核，通过诱变所造成的某一变化就会是细胞中唯一的变化，不会发生分离现象。若是双倍体或多核细胞，一般情况下，突变只发生在双倍体中的一条染色体或多核细胞中的一个核，该细胞在诱变后的培养过程中会发生性状的分离现象，必须注意进行充分的后培养。

第二、作为出发菌株，必须具有合成目的产物的代谢途径。这在选育氨基酸和核苷酸类的生产菌时尤为重要。一般情况下，若某菌株能够积累少量目的产物或其前体，说明该菌株本来就具有该产物的代谢途径，通过诱变而改变原有的代谢调控，就比较容易获得积累目的产物的突变株。

第三、选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株。选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现几率也大。生产中经过长期选育的菌株，有时会对诱变剂不敏感。在此情况下，应设法改变菌株的遗传特性，以提高菌株对诱变剂的敏感性。

②同步培养。

若出发菌株是细菌或酵母菌等单细胞微生物，一般采用营养细胞进行诱变处理。处理前，细胞应处于最旺盛的对数期，群体应尽可能达到同步生长状态，细胞内应具有丰富的内源性碱基，这样，诱变剂对群体中各细胞的处理均一，DNA被诱变剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成突变，可以获得较高的突变率。

对于某些不产孢子的真菌，可直接采用幼龄菌丝体进行诱变处理。有三种方法：第一，对菌丝尖端进行诱变处理。第二，对单菌落边缘菌丝进行处理。第三，对小段菌丝悬浮液进行诱变处理。

③诱变菌悬液的制备。

用单细胞悬浮液诱变处理的理由是：如果几个细胞在一起，诱变时受的剂量不均匀，几个细胞变异情况不一致，长出的菌落就有几种状态的细胞，每批、每代筛选结果将产生很大的误差，给筛选造成很大的麻烦，不能将真正的菌种筛选出来。

这一步的关键就是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液，要对上步培养的斜面菌种进行收集、过滤、洗涤，并用生理盐水或缓冲溶液制备菌悬液。分散均匀的菌悬液可以先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤。经处理，分散度可达90%以上，这样，可以保证菌悬液均匀地接触诱变剂，获得较好的诱变效果。

④细胞或孢子计数。

诱变处理前后的细胞悬液或孢子要计数，以控制菌悬液的细胞数或孢子浓度，以及统计诱变致死率。酵母菌细胞或霉菌孢子的浓度为10⁶～10⁷个/mL，放线菌和细菌的浓度大约为10⁸个/mL。菌悬液的细胞可用平板计数法计算活菌数，也可用血球计数板或光密度法测定细胞总数，其中以活菌计数较为准确。诱变致死率采用平板活菌计数来测定。

⑤诱变处理。

诱变处理就是选择合适的诱变剂和使用剂量处理单细胞或单孢子悬液。常用的诱变剂有物理诱变剂和化学诱变剂两大类。常用的物理诱变剂有紫外线、X射线、γ射线、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖啶类化合物等。物理诱变剂中最常用的是紫外线。选择诱变剂时要综合考虑现有条件，诱变剂的诱变率、杀菌率，使用的方便性等。目前生产上常用的诱变剂主要有紫外线、氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍等。诱变剂多为致癌剂，使用时要小心。

诱变处理不但取决于诱变剂，还与出发菌株的遗传特性有关。一般对于遗传上不稳定的菌株，可采用温和的诱变剂，或采用已见效果的诱变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂。一般不经常用同一种诱变剂反复处理，以防止诱变效应饱和；但也不要频繁更换诱变剂，以避免造成菌种的遗传特性复杂，不利于高产菌株的稳定性（图5.9）。

图5.9　诱变剂的剂量对产量变异的影响

a.未经诱变剂的处理　b.变异幅度扩大　c.正变占优势　d.负变占优势

诱变处理通常要经过多次试验确定一个合适的诱变剂量。一般来讲，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量反而会使诱变率下降。根据对紫外线及乙烯亚胺等诱变剂的研究，发现正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多出现在高剂量中。同时还发现，经多次诱变处理而提高产量的菌株，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。以前使用剂量为90%～99.9%的诱变剂，现倾向于使用70%～75%的，甚至更低，特别是经过多次诱变后的高产菌株更是如此。

如物理诱变剂中最常用的紫外线的照射剂量可以相对地按照紫外灯的功率、照射距离、照射时间来确定。一般紫外灯的功率为15W，灯与被照射物之间的距离为30cm，照射时间一般不短于几秒钟，也不会长于20min。

而影响化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用每毫升几微克到每毫升几毫克，但这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及诱变剂的延迟作用等的影响。一般来说，对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物有一个大致范围，在进行预试时，也常常是将浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。化学诱变处理的终止方法常采用稀释、解毒剂或改变pH值等方法。

⑥中间培养及单菌落分离。

对于刚经诱变剂处理的菌株，有一个表现迟滞的过程，需三代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应将处理后的细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。经过中间培养后对稳定遗传的纯种细胞进行涂布培养，分离单菌落。

其次是筛选过程，具体方法如下：

经过中间培养后可分离出大量的较纯的单菌落，接着就要从几千万个菌落中筛选出几个性能良好的正突变菌株，然后将被挑选的单菌落接种斜面后，在模拟发酵工艺的摇瓶中培养，再测定其生产能力。筛选过程需要花费大量的人力和物力，工作量很大。简洁而有效的筛选方法是育种工作成功的关键。在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛以量为主，复筛以质为主。

初筛一般是定性测定，常采用平皿反应法。平皿反应是指目标菌产生的代谢产物与培养基内的指示物作用后在平皿上出现的生理效应，如变色圈、生长圈、抑制圈、透明圈等，这些效应的大小反映了变异菌株产生相应代谢产物的潜力，可以作为筛选标志。常用的方法如下：

①纸片培养显色法。此法适用于多种生理指标的测定。如淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）大小的测定；氨基酸显色圈（转印到滤纸上再用茚三酮显色）大小的测定；柠檬酸变色圈（用溴甲酚蓝作指示剂）大小的测定来估计相应代谢产物的产量。

②生长圈法。此法是利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。

③抑制圈法。利用抗生素产生菌抑制敏感菌的生长，在菌落周围形成不同大小的抑菌圈。

④透明圈法。如蛋白酶产生菌在含酪素的培养基、产酸菌在含碳酸钙培养基上可形成透明圈，利用透明圈的大小进行初步筛选。

初筛的结果与实际生产上发酵培养的情况可能差别很大。所以，作为生产菌种的挑选还必须进行比较精确的复筛（定量测定）。复筛一般是将待测菌做摇瓶培养或在小发酵罐中进行培养，然后对培养液进行测定，选出较理想的菌种。

（3）杂交育种

两个不同性状个体内的基因片段组合到一个细胞内，经重新排列后形成新遗传型个体的方式称为基因重组。重组可使微生物在碱基对结构未发生任何改变的情况下，组合产生新的遗传型个体。真核微生物与原核微生物在基因重组的形式上有所不同。因为真核微生物的基因重组是在有性繁殖过程中发生，即在两个配子融合为一个合子并进行减数分裂时，部分染色体片段发生交换而产生重组子，如真核微生物中的有性杂交和准性杂交实质上就是基因重组。

基因重组是杂交育种的理论基础，由于杂交育种是选用已知性状的供体菌和受体菌作亲本，因此，相比诱变育种具有更明确的方向性和目的性。

生产实践上利用有性杂交培育优良品种的例子很多。如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母的两个不同菌株。面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生CO₂多，生产快；而酒精酵母的特点是产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不能供面包厂作引子用。通过两者的杂交，就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。

（4）原生质体融合育种

原生质体融合就是通过人为的方法，使遗传性状不同两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程。原生质体融合技术打破了微生物的种属界限，除不同菌株间或种间进行融合外，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合，为远缘生物间的重组育种展示了广阔前景。

原生质体融合的主要步骤是：先选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶（如细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素，真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等）去除细胞壁，再将形成的原生质体进行离心聚集，并加入促融合剂PEG（聚乙二醇）或通过电脉冲等促进融合，然后在高渗溶液中稀释，再涂在能使其再生细胞壁和进行分裂的培养基上。待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，鉴定它们是否为融合子，最后再测定其他生物学性状或生产性能。

3）基因工程

基因工程是指用人为的方法将需要的某一供体生物的DNA挑取出来，在离体条件下进行切割后（或用人工合成的基因），把它和载体连接起来，然后导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种新的育种技术。

基因工程是人们在分子生物学理论指导下的一种自觉的、能像工程一样可事先设计和控制的育种新技术，是人工的、离体的、在分子水平上重组DNA的新技术，是一种可完成超远缘杂交的育种技术。基因工程的主要操作步骤如下：

第一步是目的基因的分离。在进行基因工程操作时，首先必须取得有生产意义的目的基因，一般有三条途径，一是从适当供体细胞（各种动植物及微生物均可选用）的DNA中分离；二是通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA；三是由化学方法合成特定功能的基因。筛选好目的基因后可以通过化学合成法、物理法（包括密度梯度超速离心法、分子杂交法）、酶促合成法等方法提取所需要的目的基因。

除此之外，还要选择合适的基因工程载体，主要是质粒和病毒。载体一般为环状DNA，要求其有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点。

第二步是目的基因与载体体外重组。对目的基因与载体DNA均采用限制性内切酶处理，从而获得互补黏性末端或人工合成黏性末端。然后把两者放在较低的温度（5～6℃）下混合“退火”。由于这两种DNA是用同一种限制性核酸内切酶进行处理的，具有相同的黏性末端，因此相互之间能形成氢键，这就是所谓的“退火”。相邻的核苷酸在DNA连接酶的作用下，供体的目的基因就与载体DNA片段的裂口处能够形成磷酸二酯键，形成一个完整的有复制能力的环状重组载体。

第三步是载体传递。上述在体外反应生成的重组载体，只有将其引入受体细胞后，才能使其基因扩增和表达。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多，若以质粒作载体时，可以用转化的手段；若以病毒DNA作为载体时，则要用感染的方法。

第四步是复制、表达和筛选。在理想情况下，进入受体细胞的载体，可通过自我复制得到扩增，并使受体细胞表达出为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。

当前，由于分离纯净的基因功能单位还很困难，所以通过重组后的“杂种质粒”的性状是否符合原定的“设计蓝图”，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等能力还需经过仔细检查，以便能在大量个体中筛选出所需要性状的个体，然后才可加以繁殖和利用。目前，重组子筛选和鉴定主要通过表型法、DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法、免疫学方法和mRNA翻译检测法等方法来实现。