尿苷高产菌株代谢控制育种策略

尿苷高产菌株代谢控制育种策略

程远超¹　黄艳辉¹　刘康乐¹　徐庆阳¹　刘淑云¹　陈宁^1，2

（1.天津科技大学生物工程学院； 2.天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：选育优良的尿苷产生菌是实现发酵法生产尿苷的前提，在尿苷发酵的建立和改进中起着非常重要的作用。本文分析了枯草芽孢杆菌中尿苷的生物合成途径及其代谢机制，根据代谢控制发酵“进、通、节、堵、出”五字原理，提出尿苷高产菌的育种策略:以能大量积累乳清酸及乳清苷酸的枯草芽孢杆菌为出发菌株，使菌株在遗传学上具备2TUr 、6AUr 、UP-等遗传标记。

关键词：枯草芽孢杆菌，尿苷，育种

尿苷（Uridine，缩写UR）又称尿嘧啶核苷（Uracil riboside） ，别称：由雪核糖苷；二氢嘧啶核苷； 1-β-D-呋喃核糖基尿嘧啶。为白色针状结晶或粉末。无气味，味稍甜而微辛。分子式为C9H12N2O6，分子量为244.20。化学结构式为

核苷产品使用专业性强，是生物医学研究中不可缺少的原料，同时是制备生物药品的基本元素，尿苷可以修复导致疾病的破损基因，提高机体抗体水平，促进和改善脑细胞代谢，可以阻断各种癌细胞和病毒复制时的基因合成，并被用于制造氟尿嘧啶（S-FC） 、脱氧核苷、碘苷（IDUR） 、溴苷（BUDR） 、氟苷（FUDR）等特效生物药物。全球生物制品的销售每年以12.5%的速度增长，2000年销售额达3000亿元。根据卫生部统计数字表明，恶性肿瘤已成为中国居民主要疾病。根据国家经贸委医药司的资料，化学试剂类销售额已达33亿元，医药需求量年平均增长率为17% ，市场容量大。国际上，日本有两家公司供应发酵法生产的尿苷产品，但其供应的产品数量较少，且售价偏高。国内仅上海太平洋生物高科技公司一家曾采用RNA水解法生产尿苷，由于工艺落后，成本高，现已停产。预计国内市场年需求量约30吨，国际市场150吨，而世界目前年产量还不足50吨，所以发酵法生产尿苷市场前景看好，出口创汇可观。

传统的嘧啶核苷的生产方法是使用核糖核酸（RNA）经化学方法水解，然后制备两种嘧啶核苷，这不仅需要大量的优质RNA原料，而且两种嘌呤核苷（腺苷和鸟苷）及两种嘧啶核苷（胞苷和尿苷）都必须平衡产销，否则成本价会很高^[1]。而发酵法则是借助于微生物，具有合成自身所需核苷的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及核苷类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而能够大规模地单一地根据市场需求生产尿苷，降低此类药物的生产成本。此外，随着原生质体融合育种技术和基因克隆育种技术的发展，通过改良菌种遗传特性，克隆结构类似物抗性基因，提高关键酶的活性，也将提高尿苷的合成能力。1980年代至1990年代中期，日本科学家开始发表发酵法生产尿苷的成果，随着抗病毒、抗肿瘤、治疗艾滋病药物的深入研究，天然尿苷需求量将会越来越大，利用微生物发酵法大规模生产尿苷的方法将受到重视。

1　枯草芽孢杆菌尿苷生物合成途径及其代谢调节机制

据国外研究报道，发酵法生产嘧啶核苷的菌株与生产嘌呤核苷的菌株有许多共同特点，都要求菌株中天然的磷酸单酯酶活力很强，因此枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为最佳出发菌株^[2]，枯草芽孢杆菌中尿苷生物合成途径见图1^[1]。

在这些参与尿苷代谢的酶中，氨甲酰磷酸合成酶P是尿苷生物合成途径的关键酶^[3]，该酶催化从CO₂、NH₃、ATP生物合成氨甲酰磷酸的反应，此反应是限速反应。尿苷生物合成的第二个限速反应是由天冬氨酸与氨甲酰磷酸合成氨甲酰天冬氨酸的反应。催化该反应的天冬氨酸氨甲酰转移酶是典型的变构酶^[4]。氨甲酰磷酸合成酶P受尿苷酸抑制，氨甲酰磷酸合成酶P、天冬氨酸氨甲酰转移酶、二氢乳清酸酶、二氢乳清酸脱氢酶、乳清酸磷酸核糖转移酶、乳清酸脱羧酶各个酶都受尿苷酸阻遏，胞三磷合成酶受胞三磷抑制和胞苷酸阻遏。在诱变育种过程中只有解除这些反馈抑制或阻遏，才能获得积累尿苷的菌种。

2　嘧啶核苷高产菌的代谢控制育种策略

2.1　出发菌株的选择

为了获得尿苷或胞苷发酵产率高的菌株，尿苷产生菌的出发菌株一定要选择嘧啶核苷酸代谢能力较强的菌株。按照嘧啶核苷酸生物合成代谢图判断，乳清酸和乳清酸核苷是尿苷酸生物合成的中间体。如果选育尿嘧啶缺陷型（U-）突变株则可以在发酵过程中积累乳清酸和乳清酸核苷，能大量积累这两种产物的突变株一定有希望积累大量的尿苷。因为此类菌株尿嘧啶代谢途径相关的酶的活性很高，最适合作为尿苷生产菌的出发菌株。

图1　枯草芽孢杆菌嘧啶核苷酸生物合成及代谢调控

1-氨甲酰磷酸合成酶P； 2 -天冬氨酸氨甲酰转移酶； 3 -二氢乳清酸酶；

4-二氢乳清酸脱氢酶； 5 -乳清酸磷酸核糖转移酶； 6 -乳清酸脱羧酶；

7-尿苷酸激酶； 8-胞三磷合成酶； 9 -5′2核苷酸酶（非专一性磷酸酯酶） ；

10-胞苷脱氨酶； 11-尿苷磷酸化酶； 12 -尿嘧啶磷酸核糖基转移酶

2.2　进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收

在发酵过程中，要提供充足的碳架物质，刺激细胞对营养基质的吸收，为尿苷的合成奠定基础。Muneharu Dol^[5]等人证明，碳源中葡萄糖对产尿苷最佳，初糖浓度为18%时，尿苷产率和对糖转化率最高。

2.3　通：解除菌体自身的反馈调节，并增加前体物的合成

根据嘧啶核苷生物合成的代谢调节机制，要通过代谢控制育种手段获得尿苷高产菌，必须实现3个解除:即解除尿苷酸对氨甲酰磷酸合成酶P反馈抑制作用；解除尿苷对氨甲酰磷酸合成酶P ，天冬氨酸氨甲酰转移酶，二氢乳清酸酶，二氢乳清酸脱氢酶，乳清酸磷酸核糖转移酶，乳清酸脱羧酶的阻遏作用；解除胞三磷酸合成酶受胞三磷反馈抑制和阻遏作用。通过选育抗尿嘧啶结构类似物如6-杂氮尿嘧啶（6AU^r） 、2-巯基尿嘧啶（2TU^r）等的突变株，造就从遗传上解除正常代谢调控的理想菌株。这是因为菌体带上代谢拮抗物抗性标记后，一个可能途径是关键酶（如氨甲酰磷酸合成酶P）的结构基因发生突变，使关键酶的调节部位不再能和效应物结合，而活性中心部位却不变，因此当细胞中已有大量最终产物时仍能继续合成该产物。另一个可能途径是调节基因发生突变，使阻遏物不再能和效应物结合，因此当细胞中已有大量最终产物时，仍能继续合成有关的酶，从而解除菌体自身的反馈调节。在尿苷生产菌的选育中，常用的代谢拮抗物主要有2TU^r和6AU^r等。

2.4　节：减弱或切断支路代谢

从枯草芽孢杆菌尿苷生物合成途径上看，尿苷的前体物天冬氨酸和氨基甲酰磷酸盐与高丝氨酸的代谢关系十分密切，具体的生物合成途径如图2所示。为了阻塞分支代谢途径，可通过传统诱变选育高丝氨酸脱氢酶缺失突变株，或将菌株的高丝氨酸脱氢酶基因敲除，即使菌不产生甲硫氨酸和苏氨酸，那么将有较多的天冬氨酸盐参与尿苷的生物合成。

图2　尿苷，天冬氨酸盐和相关氨基酸的生物合成途径

2.5　堵：切断进一步代谢途径

从代谢途径中可知在发酵过程中，能大量积累尿苷的菌种还必须具备的一个关键条件是缺乏尿苷磷酸化酶活力。使在发酵过程中积累的尿苷不会转化成尿嘧啶，提高产物对糖的转化率。选育缺乏尿苷磷酸化酶突变株方法是:第一步经诱变选育乳清酸核苷酸脱羧酶缺乏的突变株（OMP2Dcase^-），它需要尿嘧啶或尿苷维持生长。第二步再诱变尿苷磷酸化酶（Upase）缺乏突变株，它在提供尿苷时生长很差，但在提供尿嘧啶时生长很好。第三步经转化方法恢复乳清酸核苷酸脱羧酶活性。或者直接敲除菌种的尿苷磷酸化酶基因，使尿苷能够大量积累。

2.6　出：促进目的产物向胞外空间分泌

在微生物中，改变细胞膜渗透性的代谢控制是非常重要的[6]。为了解除细胞膜渗透性障碍，可以选育核苷膜透性强的菌株，使合成的尿苷不断从细胞内渗透到细胞外，从而使细胞内的尿苷不能积累到引起反馈调节的浓度，尿苷就会在细胞内连续不断地被合成，又不断地透过细胞膜分泌于发酵培养基中，从而使尿苷得以大量积累。

3　枯草芽孢杆菌变异株产生嘧啶核苷的育种实例

1990年，日本武田化学工业公司的MuneharuDol^[7]、Satora Asahi^[8]等分别对尿苷和胞苷高产菌的菌种选育进行研究，枯草芽孢杆菌突变株产生尿苷的遗传性状图谱^[1，2]见图3 。

图3　尿苷产生菌的遗传性状和产率

2TU^r-二-巯基尿嘧啶抗性，6AU^r-六-杂氮尿嘧啶抗性

UP--尿苷磷酸化酶缺失，OMP-乳清苷酸，OR-乳清酸

首先选育尿嘧啶缺陷型（U-）突变株，使其在发酵过程中能大量积累乳清酸和乳清酸核苷。然后经过多次诱变选育抗药性突变株，使尿苷酸调控的六个酶和胞三磷合成酶全部被解除了反馈抑制和阻遏，而且这些酶在变异株中的活性与亲株相比都有很大程度提高，然后选育尿苷磷酸化酶缺失的突变株，这样得到在一个合适的发酵条件下能大量积累尿苷的变异株。

Yutake Tsunemi等人^[9]以上述同一株枯草芽孢杆菌为出发菌株，经亚硝基胍诱变，获得遗传标记为6AU^r+ UP^-的突变株，积累尿苷5.2g/L。以枯草芽孢杆菌122（IFO14386 ，FERMBP2859）为出发菌株，经诱变选育获得一株具有遗传标记为2TU^r+ 6AU^r+ 5FU^r+ 5FA^r+ UP^-的尿苷生产菌STA217 ，积累尿苷20g/L。

Yutake Tsunemi等人^[9]以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniform IFO12199 ，ATCC10716）为出发菌株，经诱变选育获得遗传标记为6AU^r+ 5FU^r+UP^-的突变株，积累尿苷3g/ L。以短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus IFO12088 ，ATCC6632）为出发菌株，经诱变选育获得遗传标记为2TU^r+ UP^-的突变株，积累尿苷5g/L。

参考文献：

[1]焦瑞身，乔宾福.微生物工程[M].北京:化学工业出版社，2003

[2]乔宾福.微生物产生核苷和核酸[J ].工业微生物，1998 ，28（1）:22～27

[3]张克旭，陈宁，张蓓，等.代谢控制发酵[M].北京:中国轻工业出版社，1998

[4]张克旭，杜连祥译.核酸发酵[M].北京:中国轻工业出版社，1987

[5] Satoru Asahi1 Cytidine Production by Mutants of Bacillussubtilis [J ]. Biosci Biotech Biochem ，1994 ，58（8）:1399～1402

[6]张蓓.代谢工程[M].天津:天津大学出版社，2003

[7]Maneharu Dol1 Bacillus subtilis Mutants Producing Uridine in High Yields [J ].Agric Bio. Chem ，1988 ，52（6）: 1479～1484

[8] Satoru Asahi.Method for Production of Cytidine and/ orDeoxycytidine1 United States Patent148392851J un11311989

[9]Yutaka Tsunemi. Production ofUridine. United States Patent. 48807361Nov11411989