逆向遗传分析与遗传工程小鼠

如果以能发育、演化成为生殖系的细胞作为基因转移的靶细胞，就可能将细胞水平的转基因研究发展为转基因动物或转基因植物，即整个动物或植物的每一个细胞都携带特定的转基因，这是一个全新的研究领域。

遗传学的研究通常是从生物体的突变分析着手的，通过观察与分析自发的或诱发的突变个体的表型改变来识别突变基因造成的异常或病变，进一步来识别与突变基因等位的正常野生型基因的结构与功能。然而，随着研究的深入，这样一种研究思路的局限性慢慢地显现出来了。例如，在许多胚胎期或发育早期造成致死表型的突变很可能是因为阻断了重要的发育或代谢途径而导致携有突变基因的个体夭折。遗传学家敏锐地认识到，分离和研究这类基因对于阐明生长、发育、疾病、衰老乃至生物演化等生物学和医学科学的基本问题至关重要，并由此开始探索新的研究思路。

那么，能不能把传统的思路和实验分析方法倒过来呢？即不是从分离和观察突变个体的表型来研究基因的功能，而是从已知的突变基因出发来分析它的表型效应，以及基因的结构与功能的关联。遗传学家把这种从构建或导入一个已知的突变出发来研究基因功能的实验方法称为逆向遗传学（reversegenetics），而把传统的、从异常的遗传性变异出发来研究基因的结构与功能的方法称之为正向遗传学（forwardgenetics）。根据遗传学的思路，运用基因工程技术构建基因组中携有已知结构修饰的生物，并借以研究基因的功能及其编码的蛋白质之间的相互作用，也已成为当今功能基因组学（functionalgenomics）研究的重要策略，并在生物学的理论研究，医学的基础和临床研究，农业、畜牧业、渔业相关的实验与应用研究，甚至在名犬、名马的育种研究中都取得了令人瞩目的成就。下面就以在技术上最为成熟也最具代表性的遗传工程小鼠为例来介绍转基因及相关技术的研究。

以小鼠为材料进行逆向遗传学研究有三个先决条件：①在小鼠的基因组中造成预先设定的目标基因突变；②把经过工程化修饰的突变导入小鼠的生殖细胞系（germ line）使之稳定地遗传至子裔小鼠；③对携有突变基因的小鼠进行不同发育阶段、不同组织器官的多层次表型效应分析。这些也就是遗传工程小鼠研究技术体系的主要组成部分。

利用显微注射技术把构建好的外源基因载体DNA注入刚刚受精的小鼠受精卵的雄原核，再将其移入假孕母鼠的输卵管内，任其在子宫中发育，这是将外源基因向小鼠生殖细胞系转移的最直接的途径。载体DNA除了经遗传修饰的目标基因外还包括目标基因表达的调控元件和帮助外源基因整合于原核基因组有关的DNA片段。整合了外源基因的受精卵发育而成的小鼠就是转基因小鼠，其中能表达目标基因的转基因小鼠就会获得新的功能，演绎出新的性状。这种新的性状是与转入的外源基因的结构与功能直接相关联的。1980年戈登（J.W.Gordon）和拉德尔（F.H.Ruddle）获得了第一个转基因小鼠。1982年帕尔米特（R.D.Palmiter）和埃文斯（R.M.Evans）将金属硫蛋白基因的启动子和生长激素的结构基因融合后注入小鼠受精卵。由此发育成的部分转基因小鼠中生长激素的水平比正常小鼠高出几百倍，并获得了一个比正常鼠大一倍的“超级小鼠”，引起了轰动，推动了转基因小鼠研究的开展。1987年，库恩（M.R.Kuehn）等将人的一种有关核酸代谢的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）基因成功导入小鼠基因组，开启了在活体内处于功能态的小鼠基因组背景上，分析人特定基因的结构与功能的实验研究。

然而，常规的转基因技术难以控制外源基因在小鼠基因组中的整合位点和拷贝数，从而影响目标基因的表达，甚至使插入区段的内源基因结构破坏或突变失活，严重的可造成转基因小鼠死亡。

1981年，埃文斯（M.J.Evans）、考夫曼（M.N.Kaufman）和马丁（G.R.Martin）等从小鼠囊胚期胚胎内细胞团（inner cell mass）中分离得到具有发育全能性的胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）。后又经过多年摸索，确定了在体外培养、维持、增殖ES细胞，并保持其发育全能性的实验条件。1986年，罗伯逊（E.Roberson）等用ES细胞实现了外源基因经生殖系的传递。而林（F.L.Lin）和史密萨（O.Smithies）等在哺乳动物中实现了位点特异性重组（site specific recombination），又称基因打靶（gene targeting）。基因打靶可以将经过遗传修饰的基因通过同源重组（homologous recombination），以预先设定的位置与方向整合于特定的染色体区段，从而消除外源基因随机插入后由位置效应引起的紊乱。

ES细胞的发育全能性，特别是向生殖细胞系发育的潜能，加上同源重组介导的高度受控的位点特异性重组，就形成了通过ES细胞的小鼠基因打靶技术，它为功能基因组学研究提供了在整体动物水平研究基因功能的重要技术平台。应用该技术建立的遗传工程小鼠品系已涉及数以千计的基因，其中大部分发展成为与人神经系统疾患，骨骼、肌肉发育异常，癌症，心血管疾病，免疫系统疾病，血液病，以及糖尿病等多种代谢疾病有关的疾病模型，极具基础和临床医学研究的价值。ES细胞基因打靶技术也已经成为医学遗传学的常规技术。

图6-15是小鼠基因打靶的基本流程和技术要点。图6-15a显示为了提高目标基因打靶成功的ES细胞的富集效率，在打靶载体与目标基因的某个外显子区段插入正向选择标记新霉素抗性基因（neoR），在重组区的外侧插入源自疱疹病毒的胸苷激酶基因（HSV-tk）作为负向选择标记。当打靶载体与目标基因配对并通过同源重组打靶成功，目标基因会被打断（只考虑将基因结构打断，而不必考虑该基因是否在ES细胞中表达），同时丢失HSV-tk基因。这种细胞的基因型除了目标基因呈异合态（＋/-）外，正负选择基因分别为neoR和HSV-tk，前者呈现对选择剂G418的抗性，后者会拮抗一种能杀死携带HSV-tk而不影响寄主细胞内源TK的细胞的药物FIAU。所以打靶成功的ES细胞可以在含有G418和FIAU的培养基中存活，而在大多数情况，打靶载体会通过非同源重组将整个载体随机插入寄主细胞基因组，致使HSV-tk基因与neoR同时保留，如图6-15b。这种细胞不仅没有打断目标基因，还会因HSV-tk基因的存在而被FIAU杀死。图6-15c和d分别显示把经过正负双向选择筛选并克隆中打靶成功的ES细胞注入小鼠植入前的囊胚期胚胎，再将此囊胚期胚胎借助外科手术移植至代孕小鼠的输卵管任其移入子宫发育。为了便于从子代中分离到能将突变基因传递至子裔的小鼠，分离ES细胞的小鼠和作为囊胚受体的孕鼠可选择毛色区别明显的小鼠品系，一般可从Agouti小鼠分离ES细胞，从黑色小鼠采集囊胚，这样，子代中小鼠毛色的嵌合比例可用来评估ES细胞对嵌合小鼠的融入程度。最后，通过嵌合小鼠与黑色小鼠的交配繁育的子鼠的毛色来评估ES细胞对生殖系细胞的贡献。

图6-15　小鼠基因打靶流程示意（改自M.R.Capecchi）

ES细胞基因打靶的技术关键是打靶载体（targeting vectors）的设计和构建。打靶载体是用于染色体上特定位点的基因重组和突变的DNA分子构件，它的基本组分是载体骨架、打靶位点两侧的同源重组臂。考虑到DNA转染和基因打靶都是小概率事件，往往还需在载体中组装正向和负向的选择标志，以便有效地筛选符合实验要求的打靶产物。根据打靶的具体要求，在载体上还可以组装报告基因（reporter）或调控元件（regulatory elements），分别执行基因剔除（gene knock-out）、基因敲入（gene knockin）、引入精细突变（fine mutation）和基因捕获（gene trapping）等功能。每一类载体又可细分为若干种，如基因捕获载体又可分为专门捕获基因编码序列（coding sequence）、基因表达增强子（enhancer）、启动子（promoter）、外显子（exon）、内含子（intron）和多聚腺嘌、呤加尾信号序列（polyadenylation site）等功能各异的DNA片段的专一性载体。载体的特殊结构不仅决定了打靶后重组等位基因的结构，也决定了由此产生的遗传工程细胞和小鼠的表型分析程序。

还有一类可造成时空可调的条件性基因打靶（conditionalgene-targeting）的特殊载体。可以设想，从一个特定基因被剔除的ES细胞衍生而来的小鼠，它的每一个细胞都不能行使那个被剔除的基因的功能，而且这种缺失功能状态会从胚胎时期起一直持续终生。如果这个基因在自然情况下应在胚胎早期表达，并在以后各个发育阶段都起着重要的作用。那么，该基因被剔除的小鼠就会致死。为了分析这类基因在各个发育阶段和不同组织器官中的功能，就必须将基因剔除限制于特定的生长发育阶段和组织类型，这就是发展条件性基因打靶的思路。循着这个思路科学家们能够设计出性能独特的条件性基因打靶载体，并建立多种控制打靶的时间（不同发育阶段）和空间（不通组织器官）的实验体系。例如，最常用的Cre-loxP系统。Cre是一种源于噬菌体P1的位点特异性重组酶（site specific recombinase），分子量为38 000，它识别的重组靶序列是由34个碱基对组成的loxP。Cre酶不仅可在原核细胞中介导DNA位点特异性重组，在哺乳动物细胞中也能介导同样的反应，前提是在基因组的某个位置装入loxP序列。所以。只要在ES细胞基因组的特定位点装上loxP，就可以利用Cre酶把外源DNA序列整合于这个特定位点，也可以在这个位点造成设定的结构重排。再进一步，将编码Cre基因与组织特异性启动子组装在一个载体上，就可以实现组织特异性的基因剔除（图6-16）。同样的，将Cre基因置于可经药物诱导的启动子控制之下，如四环素调节系统，即可在适当的时候，用药物诱导Cre基因表达，从而实现在特定时间的基因剔除。应用Cre-loxP系统还可以在野生型或突变型小鼠中做细胞系谱（lineages）的基因示踪研究，绘制出反映细胞在整个胚胎发育过程演化的细胞命运图。常用的另一种与Cre-loxP类似的位点特异性重组系统是源于啤酒酵母的Flp-FRT系统。

图6-16　细胞组织特异性基因打靶的Cre-loxP实验系统示意（引自T.Strachan和A.P.Read）

（a）先在ES细胞基因组的特定位置装入loxP序列，借以进行以A基因为目标的基因打靶。鉴于Cre酶针对不同位置的loxP序列可能产生携带不同重组修饰的ES细胞，所以需要选择符合设计的ES细胞；（b）将目标基因A两侧装有loxP序列的小鼠与携带了与Cre基因连锁的细胞或组织特异性启动子P的转基因小鼠交配，再选择同时携带两种遗传标记的杂合小鼠来建立能在特定组织或细胞中造成打靶目标A功能丧失的实验小鼠品系

基因克隆（gene cloning）、同源重组、定点突变（site directed mutagenesis）和位点特异性重组的结合，加上巧妙的选择系统，使得设计和构建可在基因组中产生从单碱基替换、微小缺失直到染色体上超过百万个碱基对的大片段的倒位、易位、重复等结构重排的各种打靶载体成为可能，极大地增强了对整个基因组的各类组分的干预能力。1999年启动并于2002年12月宣告完成的小鼠基因组测序计划以及相应的新概念和新技术的引入，进一步提高了载体设计的精确性，也更符合医学和药物研究的需要。

从生物体的结构和生物学研究层次上讲，细胞是生物最基本的结构与功能单位，也是生物学家研究生命活动的基本材料。有关细胞生长、增殖和衰亡；细胞的物质和能量代谢，基因的复制和染色体的组装，基因的精细结构及其在活细胞中的表达，基因编码的产物之间的相互作用及信号转导（signal transduction）的知识，大多数来自对体外培养细胞长期而系统地观察和分析。然而，体外培养的细胞脱离了机体的血液循环系统、神经内分泌系统和免疫系统等的调节，也不能再现组织器官和各功能系统的分化发育过程。正是在哺乳动物整体水平上应用逆向遗传分析的遗传工程小鼠研究，为我们提供了大量在体外研究中难以获得的新知识，更新了对基因和基因功能的认识，尤其是关于遗传背景和机体内外环境因素对基因突变的表型效应的动态知识。同时，也为医学研究提供了可以进行多种干预性研究的哺乳动物整体模型，并借以在基因结构变化和功能表达水平分析疾病发生和发展过程中的关键性事件。

早在1910年，美国洛克菲勒医学研究所的劳斯（P.Rous）就曾用鸡的肉瘤组织的无细胞滤液在健康的鸡体内成功地诱发出同样的肉瘤，并据此提出了病毒致癌假设。差不多经历了半个世纪的质疑、争论和实验研究，病毒可以在一定条件下导致恶性肿瘤的学说才被广泛接受。劳斯分离到的病毒被命名为劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）。研究表明劳斯肉瘤病毒的基因组中有一个能编码导致肉瘤蛋白质的基因，它就是世界上第一个被分离和克隆的癌基因（oncogene）Src。Sr基因及其编码的蛋白质是使劳斯肉瘤病毒感染的寄主细胞转化为恶性肿瘤细胞并维持恶性转化表型所必需的。此后的大量研究还表明，包括小鼠和人在内的绝大多数哺乳类动物的基因组中都存在Src的同源基因，该基因的结构和功能异常也可能引起恶性肿瘤。那么，在正常的生理条件下Src基因的功能是什么呢？细胞生物学和动物生理学研究表明，Src基因在小鼠的血小板和神经元细胞中高表达，还发现细胞有丝分裂时，Src编码的蛋白质出现特定氨基酸的磷酸化，提示Src基因的功能可能与凝血和中枢神经功能相关，也可能与细胞生长和分裂周期的调控有关。然而，应用小鼠胚胎干细胞基因打靶技术制备的Src基因无效突变的纯合子小鼠在出生后数天内就会死亡，而突变的杂合子小鼠（即两个Src等位基因中只有一个突变，而另一个正常）则因骨质重建缺陷而造成硬骨症。无论是突变的纯合子还是杂合子都没有出现基于体外实验结果所期望的血小板功能异常和脑组织结构异常。又如，与人视网膜母细胞瘤（retinoblastoma）的易感性直接相关的致病基因Rb是最早被发现的肿瘤抑制基因（tumour suppressor），该基因编码的蛋白质对细胞生长周期有负调控作用。世界上已有几个实验室得到了Rb基因剔除小鼠。突变纯合子小鼠会在胚胎期死亡，病理解剖显示胎儿的神经系统和造血系统出现严重病变，突变杂合子小鼠则有强烈的致癌倾向。出乎意料的是，预期的视网膜母细胞瘤并没有发生，出现的却是脑瘤和垂体瘤，原有的一个野生型Rb基因在瘤细胞中也因体细胞突变而失活。

Src和Rb基因剔除实验说明，遗传工程小鼠可以用来证实癌基因激活或抑制癌基因失活会增强机体的致癌倾向。那么，可不可以用类似的模型来回答诸如“乙型肝炎病毒的感染会不会导致肝癌”这样的问题呢？临床观察表明感染了乙肝病毒的患者中，有一部分会患慢性活动性肝炎，继而发展为肝纤维化或肝硬化等慢性肝病，最后可能演化为肝细胞癌。这些由病毒感染的免疫反应引起的肝细胞死亡/再生的重复周期似乎是乙肝病毒导致肝癌的重要途径。通过对乙肝病毒全基因组的转基因小鼠的观察，发现乙肝病毒的大分子外壳多肽的过度表达会引起肝细胞损伤、炎症和再生性增生，并可能使恶变的风险增加。此外，乙肝病毒X基因的转基因小鼠也会出现从变性肝细胞灶到腺瘤，再演变为肝癌的进行性病理过程。在乙肝病毒转基因小鼠中呈现的这个过程和临床观察到的部分乙型肝炎患者向肝癌演变过程是一致的。

基因剔除不仅可以获得特定基因的失功能突变小鼠来阐明该基因正常蛋白产物的功能，还可以用来获得人类遗传病的模型。一旦某种遗传病的疾病基因被识别和克隆，致病的突变也弄清楚了，就可能借助遗传工程操作造成小鼠同源基因的突变，进而构建相关的疾病模型。据不完全统计，目前已建成的遗传工程小鼠疾病模型已涉及上千种不同的疾病基因，包括中枢和外周神经系统及肌肉病变性疾病，免疫系统和造血系统疾病，骨、软骨和皮肤疾患，以及数十种恶性肿瘤等。这些模型提供了一个处于生长、发育、病变和衰老动态过程中，且可以从疾病演进过程中不同的时间点和特定的组织、器官进行多种干预的解析力极高的技术平台。通过疾病模型可以从基因结构变异和功能表达异常来研究病变的全过程，寻找可能被药物干预的分子靶标，为发展新药提供有价值的思路。不仅如此，这样的疾病动物模型也是从安全性和有效性两方面对药物进行初筛的实验系统。

1984年梅尔顿（D.W.Melton）克隆了莱施-奈恩综合征（Lesch-Nyhan syndrome）的疾病基因HPRT。莱施-奈恩综合征是一种引起神经和行为异常的伴性隐性遗传病，HPRT位于X染色体上，是一个在体内各种组织广泛表达的持家基因，它编码的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶在人的嘌呤核苷酸代谢的补救旁路中起关键作用。1987年，胡珀（M.L.Hooper）等为了获得莱施-奈恩综合征的小鼠模型，做了HPRT基因剔除小鼠，但并未观察到与莱施-奈恩综合征相关的神经系统异常。同年，库恩等的类似研究也得到了同样的结果，随后的医学生化研究表明啮齿类动物与人的嘌呤代谢是不一样的，腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）的作用更为重要。1993年吴（C.L.Wu）和梅尔顿将APRT的抑制剂导入HPRT基因剔除小鼠，确实诱导出了有持续自残行为的小鼠，而这正是莱施-奈恩综合征患者的行为特征之一。从这个例子可以看到不同物种间代谢差异，也可以看到内外环境因子是会影响疾病基因突变的表型效应的。

另一个例子是纤维囊肿的疾病相关基因CFTR。1992年有三个研究小组几乎同时构建了CFTR基因缺陷突变小鼠，其中两个小组用替代型打靶载体剔除了ΔF508所在的10号外显子，另一个小组用插入型载体阻断了10号外显子的表达。两种方法产生的突变纯合小鼠的表型不完全一样。用替代型载体获得的10号外显子剔除小鼠很快丧失了环腺苷酸激活的氯离子通道活性，出现类似CF患者的远端小肠梗阻而死亡，胰腺和泪腺也有明显病变。而用插入型载体阻断10号外显子的小鼠并未出现典型的临床症状，仅出现少许病理性改变。

动物模型之间的表型差异可以归因于对CFTR基因替代和插入两种遗传修饰的类型不同。插入型修饰虽有可能使10号外显子表达受阻，但10号外显子序列仍然存在，原始转录产物也可能经不同的拼接而生成野生型或拟野生型的mRNA，这种在编码外显子中的插入突变仍可经拼接而在较低水平形成有功能的全长mRNA和蛋白产物的例子是非常值得注意的。

事实上，迄今为止从患者身上已经分离鉴定到1 500多种不同种类的CFTR基因突变，这些突变覆盖了整个基因，每种突变都有不同的病理特征，有的完全不能合成蛋白质，有的合成部分受阻，有的调控紊乱，也有一部分是接近正常表型的。可以设想我们也许不仅仅需要构建一种CFTR突变的遗传工程小鼠，而是要构建包括各种已发现的突变，和在自然界尚未发现但可能存在突变的一个完整的系列。这样我们就有了一个完整的基因突变谱，而且有了一个能表现患者各种症状的相应的遗传工程小鼠库，这必将极大地推动疾病的基础性研究以及诊断和防治技术更新。再深一层考虑，任何一种疾病的发生、发展和转归都会涉及多种遗传和环境因素之间错综复杂的交互作用，疾病基因的突变谱和遗传工程小鼠库对相关的分析也是有价值的。

基因打靶已经产生了许多重要的人遗传病的模型。但多数属单基因疾病，这些疾病的遗传方式是清楚的。如果研究的疾病是涉及多个基因，并明显受环境因素和生活方式影响的复杂病变，动物模型的获得就要困难得多。譬如说原发性高血压是常见病、多发病，其病理过程十分复杂。正常血压的维持与心脏的功能、外周血管系统的状况、总的血量、肾功能，以及离子平衡密切相关。血管紧张肽原酶/血管紧张肽系统也是维持正常血压的重要系统，许多降压药就是这个系统的相关因子，如血管紧张肽转移酶和血管紧张肽受体为作用靶的。显而易见，这种多基因遗传病的动物模型构建不仅要对多个基因一一加以结构功能剖析，而且更难的是如何明确各个因素与高血压之间的因果关系，也就是说要在一次实验中只对单个可变因素的作用进行基因型与表型的相关分析。史密萨等为了验证“血浆中随基因变化的血管紧张肽原Agt的浓度是引起血压升高的一个因素”这个假设而做的基因打靶实验无疑是非常有说服力的。第一步，他们用传统的ES细胞基因打靶技术获得了Agt基因剔除小鼠。第二步，应用缺口修补基因打靶技术（gap-repairgene targeting）在Agt基因所在的染色体位置上使正常的野生型Agt基因的拷贝数重复而加倍，这些基因也置于原有的Agt基因一样的调控因素之下。通过不同的杂交组合就可以获得Agt基因拷贝数分别为0、1、2、3、4的遗传工程小鼠。这5种模型小鼠群随Agt基因拷贝数的增加，血浆中的血管紧张肽原浓度呈现一个稳定的梯度，这个浓度梯度与血压的增高呈显著相关性。这个巧妙的被称为基因滴度（gene titration）的实验表明，只要设计恰当，基因打靶实验就能检测出一个完全独立于遗传背景和复杂环境因子的基因在多基因疾病中的作用，并对这个基因与特定症状出现之间的因果关系做出毫不含糊的判断。

现在不仅能在单个基因水平上构建遗传工程小鼠，还可以通过染色体水平的重排构建疾病模型。譬如，迪乔治综合征（DiGeorge syndrome）是一种在新生儿中发病率为1 /4 000的严重先天性心脏缺损疾病，伴有甲状旁腺功能减退、免疫功能低下、面目怪异和学习障碍等症状，80%的患者的22号染色体有3Mb（300万个碱基对）的大段缺失，涉及30个已知的基因。最近巴尔迪尼（A.Baldini）等根据小鼠和人的比较基因组学研究，发现患者缺失的22号染色体的3 Mb区段与小鼠16号染色体上的一个1.6 Mb片段是同源的，于是就利用Cre-loxP系统，成功构建了该区段缺失并出现典型的迪乔治综合征症状的小鼠模型，为在小鼠中模拟人类的染色体病开辟了一条新的路子。

与大段染色体缺失会引起严重疾患一样，染色体或染色体片段的重复和冗余也会致病。唐氏综合征（Down syndrome）就是由于多了一条21号染色体造成的，其中关键的重复区段是长臂2区2带（21 q22.2）。新生儿的发病率高达1/1 000～2/1 000，患儿智力低下、精神呆滞，常伴有先天性心脏病或血液系统疾病。为了详细分析21q22.2区段上各部分基因与发病的关系，史密斯（D.J.Smith）等首先把人的21 q22.2区段切成一组首尾序列有一定程度重叠的长度约为2Mb的片段，然后应用大片段DNA转基因技术，建立了一个转基因小鼠组合系；即由一组遗传工程小鼠组成的DNA分子叠连群（contig），成为分析唐氏综合征有关的各种染色体异常的“活试管”。

利用遗传工程小鼠所做的研究往往会证实某些假设，也可能会推翻某些假设，但很少是不提供任何信息的无效实验。例如钙调素（calmodulin）是一种与信号转导和多种酶的作用有关的钙结合蛋白。有人发现钙调素基因过度表达的转基因小鼠会在出生后数小时诱导出极早期糖尿病。另外，也有人发现Ⅰ类组织相容性因子H-ZKb在胰腺β细胞中过度表达的转基因小鼠也会衍生出胰岛素依赖性糖尿病，而且不出现预期的自体免疫反应。这类实验结果会启发我们对糖尿病成因的再思考，也会为糖尿病的防治找到新的思路。只要实验是可靠的，逐步积累总会导致有价值的科学发现。

诚然，通过基因捕获（gene trap）可以构建携有随机插入突变的胚胎、干细胞库，但从突变的胚胎干细胞到可以观察性状的突变小鼠系列仍然是繁重和困难的任务。利用乙基亚硝基脲（ethylnitrosourea，ENU）诱发小鼠基因突变则为哺乳动物功能基因组的研究提供了一种新的方法。ENU是一种能引起单碱基突变的烷化剂，它不依赖细胞内的代谢活化系统就可以通过烷化反应将乙基加合于碱基，造成DNA复制中碱基的错配与置换。ENU在小鼠减数分裂前的精原细胞和胚胎干细胞中的单位点诱变率可达10-3数量级。对小鼠全基因组的ENU诱变研究已被国外多个实验室用于基因功能研究和疾病模型构建。这些研究有三个显著的特点：① ENU诱变的分子机制是清楚的，诱变是随机的，几乎能覆盖整个小鼠基因组；②突变基因的定位充分利用了分子生物学标记和生物信息学数据；③突变型筛选和表型分析是高通量大规模的，包涵发育的全过程和几乎所有器官组织，还涉及分子、细胞、器官和整体多个层次。这几点也许可以将ENU诱变实验与经典的小鼠遗传学中的诱变实验和表型驱动分析加以区分。一些诱变工具小鼠的开发和多种基因组工程化修饰技术的利用更是大大提高了ENU诱变系统的效率。在多种模式生物基因组测序完成的基础上，它已经成为快速产生和大规模筛选疾病模型的又一种有效手段。

如果说基因组研究正在从结构基因组向功能基因组转变，遗传学正在从研究单个基因向基因家族和整个基因组的功能协调研究转变，那么值得注意的一个新生长点是，针对一种遗传性疾病（包括多基因病），构建一个具有不同结构修饰基因的遗传工程小鼠集合来分析基因结构变异与临床症状之间的确切关联，这种关联应该包括质的关联和量的关联。认识到这一点对医学遗传学研究是十分重要的。当然，收集病例和相应的基因样品是根本的、至关重要的。然而，遗传工程小鼠模型提供的技术平台，不仅是研究思路的创新、研究方法的创新，也是生物学与医学新一代研究材料的创新。在新老世纪交替之间它正在悄悄地引发一场医学科学乃至整个生命科学的革命。

人类基因组测序计划的完成，以及大肠杆菌、线虫、果蝇、拟南芥和小鼠等模式生物基因组序列的公布，为我们提供了大量有关生物遗传组成的资料，估算出了每种生物可能编码蛋白质的基因（又称可读框，ORF）的数目，排出了长长的基因名录。然而，基因组序列资料并没有直接演绎出基因组编码的种种RNA和蛋白质是以何种方式相互整合来执行细胞生长发育分化功能，以至于形成整个机体的形态、生理和行为等表型特征。基因组及其各个组成的功能研究，或者说功能基因组学的一个重要任务就是要识别和阐明与健康、亚健康和疾病状态相关联的基因的结构与功能，以及处于这种结构和功能态的基因与环境因素的相互作用。

对于基因组序列已知的生物来讲，发现和研究基因功能最有效的方法是运用分子生物学提供的工具和方法，使基因组中的基因逐个失活（loss of function），再分析特定基因失活在分子水平、细胞水平或整体水平上的效应。在酵母Saccharomyces cerevisiae基因组序列公布后，参与酵母基因组删除研究项目（The Saccharomycesgenome Deletion Project）的科学家基于同源重组原理，对酵母全基因组每个有编码蛋白质潜能的ORF逐一做系统的缺失突变，最终在总共6 131个基因中获得了5 916个基因的缺失突变株，突变基因的覆盖率约为96.5%。这些突变株成为真核生物功能基因组学研究的第一批宝贵材料。

美国Salk研究所的埃克特（J.Ecker）小组利用携带了卡那霉素抗性基因的土壤杆菌Agrobacterium T-DNA作为插入突变的序列标记，对模式生物拟南芥Arabidopsis thaliana全基因组做插入突变系列研究，获得了15万个插入了T -DNA的突变株，并对88 000多个插入突变做了精确的定位，在拟南芥具有的29 454个ORF中总共鉴定了21 700个基因的突变株。在提供高覆盖率突变库的同时，研究小组还对部分结构基因和调控基因做了较为深入的功能分析。

在模式生物线虫（Caenorhabditis elegans）中，常用RNA干扰（RNA interference， RNAi）来使基因失活。RNAi的作用与经典的基因剔除是类似的。在自然条件下，RNAi是细胞抵御转移性遗传因子或病毒侵袭的一种保护机制，现已被广泛用于暂时性阻断特定基因的表达，借以分析该基因功能失活后的形态、生理和行为效应。具体方法是将编码针对特定基因的双链RNA的质粒导入大肠杆菌，然后用这种大肠杆菌喂饲线虫，即可观察子代线虫在胚胎期或幼虫期因特定基因失活而导致的表型效应。卡马特（R.S.Kamath）等应用RNAi阻断了16 757个线虫基因（基因总数估计为19 757）的表达。系列的表型分析表明在进化上越是保守的基因的失活，越容易引起致死效应。阿什拉菲（K.Ashrafi）等还用相似的方法分析了与脂肪代谢的调节相关的基因。