酵母双杂交

随着生物技术的不断发展，研究蛋白质相互的技术日益完善，各种新技术也不断涌现，目前常见的包括酵母双杂交方法、Pulldown方法、免疫共沉淀方法、荧光共振能量转移技术、BioCore共振光谱学分析技术等。其中酵母双杂交技术作为经典的大规模筛选、发现和验证在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台和方法，得到了广泛的应用。

酵母双杂交系统是在20世纪80年代由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的。该系统以真核模式生物酵母（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae）为模型，在体内（酵母细胞内）研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。

（一）技术优势

大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。酵母细胞作为报道株具有许多优点：酵母细胞是真核细胞，具有真核细胞转录调控的一般特点；酵母易于培养、生长周期短，易于转化、便于回收扩增质粒，具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因，并且酵母的内源性蛋白不易与来源于哺乳动物的蛋白结合。因此，酵母细胞成为生物学研究的理想模型。与近年发展起来的研究蛋白质相互作用的一些新方法相比，酵母双杂交技术仅仅需要基本的分子生物学和微生物学试验设备，不需要借助价格昂贵的大型仪器设备，适合在大多数生物学实验室开展。正因为以上因素，它在众多的研究领域中有着广泛的应用。

1．发现、研究新蛋白的相互作用及其功能 细胞由成千上万的蛋白组成，这些蛋白间具有复杂的相互作用，从酵母双杂交系统建立之初，该方法就成为研究蛋白相互作用的重要手段之一。在研究某个蛋白的功能时，寻找与其相互作用的蛋白为研究该蛋白的功能可以提供重要的线索。因此酵母双杂交系统也是研究蛋白功能的重要手段之一。

2．寻找、鉴定新基因 酵母双杂交技术也是发现新基因、研究新基因功能的重要途径。在人类基因组计划完成之前，研究者在利用酵母双杂交系统筛选和已知蛋白相互作用的蛋白时，当我们将已知蛋白为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白时，常常可以得到功能未知甚至未报道过的新基因编码序列，这曾经是发现新基因的重要途径之一。即使在基因组计划完成的今天，很多新基因也只是完成了序列测定，其功能尚不明确，在进行酵母双杂交筛选时，还是可以筛选到这些功能不明的新基因，从而为这些新基因的功能研究提供重要线索。

3．建立蛋白质相互作用网络 随着蛋白质组学的发展，各种高通量的蛋白质组技术日益成熟。酵母双杂交系统也向着这个方向进行了改进，产生了“库”筛“库”的酵母双杂交系统。该系统不再以单个或几个蛋白为诱饵筛选特定的文库；而是利用“文库”直接筛选“文库”，从而得到文库中所有蛋白相互作用的全景图，成为真正意义上的蛋白质组学研究方法。例如，2005年Cell杂志报道，德国的一个研究小组利用酵母双杂交系统进行了高通量的蛋白相互作用筛选，在由4 456个bait蛋白库和5 623prey蛋白库进行的筛选中，他们获得了1 705个蛋白间较新的3 186种相互作用，构建了人类蛋白相互作用网络。

由此可见，酵母双杂交系统作为研究蛋白相互作用和功能的重要的经典方法之一，在今后的生物学研究中也一定会具有更加广泛的应用。

（二）技术特点

下面以应用最为广泛的Clontech公司酵母双杂交系统MatchMaker System 2为例，具体介绍酵母双杂交技术特点。

许多真核细胞转录因子都由两个独立的部分组成：即DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（transcription activation domain，AD）。其DNA结合结构域可识别并结合DNA上的特异序列，从而使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，并可与其他参与转录激活的因子协同作用，启动其下游的基因的转录。转录因子的这两个结构域在结构和功能上都有一定的独立性，因此BD和AD分开独立表达时，各自具有独立的功能，而且独立表达的BD和AD在空间位置上相互靠近时，仍可以启动下游基因的转录。酵母转录因子GAL4正是这样，其DNA结合结构域（DNA-BD）结合GAL4调控基因的上游序列（UAS），而其转录激活结构域（AD）与其他转录蛋白结合，从而起始转录。这两个结构域必须同时存在并相互接近才能激活转录。如果用重组DNA技术将两个相互作用的蛋白分别融合于GAL4-DNA-BD和GAL4-AD结构域之后，然后共转化酵母，那么就可以激活上游具有GAL4结合位点的基因（如LacZ和His3）的转录。如图9-1所示。

酵母双杂交系统正是利用上述原理来检测蛋白-蛋白的相互作用。所谓“双杂交”，是指利用两类嵌合蛋白进行筛选。其中一种蛋白（X）与DNA结合结构域融合（BD-X），另一个蛋白（Y）或是一个cDNA文库与转录激活结构域融合（AD-Y）。以基于酵母转录因子GAL4的系统为例，GAL4-BD具有核定位序列（nuclear-localization sequence），其AD没有，因此在GAL4-AD氨基端或羧基端克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。这样形成的融合蛋白在酵母中表达后可以进入细胞核，一旦X-Y可以相互作用，GAL4BD-AD就可以启动下游报告基因的表达，进行营养筛选或是β-半乳糖苷酶显色反应。

图9-1　酵母双杂交原理

早期的酵母双杂交系统只采用了β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因，这样的严谨性往往不够。在随后的改进中，系统多采用三报告基因系统，如ADE2、HIS3和LacZ。为了降低外源蛋白表达对酵母细胞产生的毒性，并提高系统检测的敏感性，也发展出了基于细菌LexA蛋白的LexA酵母双杂交系统。

（三）技术改进

由于酵母双杂交系统的强大功能，它在生物学研究中得到了广泛的应用，并且随着其应用的不断深入和广泛，酵母双杂交系统也得到不断的发展和改进。下面简单介绍近年来改进的一些新系统。

1．膜相互作用的酵母双杂交系统（membrane-based yeast two-hybrid system） 传统的酵母双杂交系统为嵌合蛋白加入了入核信号，使其能够进入细胞核，如果有相互作用，就能调控下游报告基因的转录。然而即使加入核定位信号，很多膜蛋白也很难进入细胞核中。有研究认为在所有的蛋白中，超过40%的蛋白锚定在膜上或与膜结合，这些蛋白及其相互作用的蛋白具有非常重要的功能。虽然利用传统的酵母双杂交系统研究膜结合的蛋白的相互作用也有成功的例子，但是传统的酵母双杂交系统还是不适合大多数膜结合蛋白的相互作用的研究。因此，一些新的策略被应用，从而产生了一系列基于膜相互作用的酵母双杂交系统，如Sos recruitment system、Ras recruitment system、Split-ubiquitin membrane-based system酵母双杂交系统等。

下面先以Sos系统为例简单介绍其原理。该系统利用一种温度敏感的酵母突变株来进行双杂交筛选。该酵母温度突变株由于Ras信号通路的缺陷，导致酵母细胞不能在36℃下生长。Sos蛋白作为GEF（guanyl nucleotide exchange factor），能够将RasGDP催化成为Ras-GTP活性形式，活化下游信号通路，从而使突变株可以在36℃下生长。根据这个原理，将bait蛋白（X）与人Sos蛋白融合表达，prey蛋白（Y）通过豆蔻酰化信号序列而定位在膜上。如果X与Y不能相互作用，该酵母突变株在36℃仍不能生长；如果X与Y有相互作用，Sos就被募集到膜上，从而活化酵母Ras蛋白，激活下游信号通路，使温度敏感的酵母突变株在36℃下恢复生长。该系统不需要嵌合蛋白入核，弥补了传统酵母双杂交系统的缺点。与这个系统类似的基于膜的酵母双杂系统还有Ras recruitment system（RRS）和基于G蛋白的系统（G-protien based system）等（图9-2）。

图9-2　Sos修复系统原理

A．X与Y无相互作用，酵母菌不生长；B．X与Y有相互作用，酵母菌生长

Split ubiquitin membrane-base酵母双杂交系统是另一个基于膜相互作用的系统。该系统利用了参与蛋白降解途径的泛素，泛素是由76个氨基酸构成的小蛋白，参与蛋白的降解途径。而泛素特异的蛋白酶可以识别泛素，可以将共价结合在蛋白上的泛素切割下来。基于这个原理，在实验中，将泛素分为N端（1～37氨基酸，NubG）和C端（35～76氨基酸，Cub）两部分（就像转录因子的AD和BD一样），bait蛋白与泛素的C端以及转录因子融合表达，prey蛋白则与泛素的N端融合表达（其N端有点突变，不能自发与泛素C端相结合，因此只能通过bait和prey蛋白的结合才能使泛素的C端与N端结合在一起）。一旦bait蛋白与prey蛋白有相互作用，泛素分离的N端与C端就结合在一起，能够被泛素特异的蛋白酶识别，泛素连接的转录因子被切割下来，进入细胞核，激活报告基因的表达。其原理如图9-3所示。

2．双诱饵酵母双杂交系统 在传统酵母双杂交系统基础上，有研究者发展了双诱饵酵母双杂交系统，以同时筛选鉴定两种蛋白的相互作用蛋白。该系统基于LexA酵母系统。bait1与LexA BD融合，而报告基因Leu2和LacZ的表达受LexA操纵子调控，因此可以通过检测Leu2和LacZ来筛选与bait1相互作用的蛋白；同时系统还引入第二套筛选体系：bait2与来源于噬菌体的cI蛋白的结合结构域融合，而报告基因Lys2和gusA的表达受cI操纵子的调控，可以通过检测Lys2和gusA来筛选与bait2相互作用的蛋白（图9-4）。这样，在一个系统中就可以同时筛选或验证两种蛋白的相互作用蛋白。该系统中，bait2可以选用一个非特异性的蛋白，作为系统的对照；或者bait2也可以是bait1的突变体，因而突变体与正常的蛋白在一个系统中形成对照。

图9-3　Split-ubiquitin membrane-based system原理

3．反式酵母双杂交系统 反式酵母双杂交系统利用突变和双杂交原理来确定对于相互作用非常关键的氨基酸或是肽段。传统的酵母双杂交系统都用于筛选或验证相互作用的蛋白，而在确定相互作用的蛋白之后，为了进一步确定相互作用的关键氨基酸或结构域，一些研究者发展出了反式酵母双杂交系统，用该系统来寻找蛋白的突变体，这些突变体会破坏原有的相互作用。以相互作用的蛋白X与Y为例，当利用酵母双杂交系统确定X与Y相互作用后，为了进一步确定X、Y相互作用的关键氨基酸，可以将X、Y都分别突变，然后进行反式酵母双杂交。我们以蛋白Y的随机突变为例，利用没有校读功能的Taq DNA聚合酶扩增Y的编码序列，得到随机突变的Y蛋白的突变体序列库，构建进入反式酵母双杂交系统载体中，用于随后的反式双杂交。Y蛋白的随机突变体中，一些对于相互作用非常关键的氨基酸的突变体会部分或全部破坏X、Y间的相互作用，导致报告基因表达水平的下降（与X、Y相互作用的正常情况对比）。而通过对这些突变体的分析就可以找到X、Y相互作用的关键氨基酸。一些反式酵母双杂交系统利用酵母的生长作为检测指标，其使用的报告基因对酵母细胞具有毒性，当X、Y有相互作用时，报告基因表达，酵母不能生长；而当X与Y突变体没有相互作用时，报告基因不能表达，酵母则可以生长。

由于酵母双杂交系统在蛋白质相互作用的研究中具有极重要的意义和广泛的应用，很多公司发展出了多种成熟的商品化的系统。具体步骤可以参考应用较广的Clontech公司的MatchmakerYeastTwo-HybridSystem2手册。

图9-4　dual-bait yeast two-hybrid system原理

下面以2005年Cell杂志的一篇文章“Navigating the Chaperone Network：An Integrative Map of Physical and Genetic Interactions Mediated by the Hsp90 Chaperone”为例，具体分析酵母双杂交系统的应用。这篇文章希望筛选寻找与Hsp90的相互作用蛋白，Hsp90是真核细胞中重要的分子伴侣之一，参与多个重要的细胞信号转导过程。作者利用酵母双杂交系统（基于Gal4的系统），将酵母Hsp82（酵母Hsp90的一个isoform）的全长及分段：N端（1～220氨基酸残基）、中间段（271～599氨基酸残基）、C端（599～709氨基酸残基）融合在Gal4DNA结合结构域的C端，然后筛选了一个含有6 084个克隆的阵列（array），以Gal4的空质粒作为阴性对照。为了降低实验的假阳性率，每个筛选都进行了6次。最终筛选到90个克隆特异地并可重复地与Hsp82全长或其片段相互作用，其中包括一些已经证明与Hsp90具有相互作用的蛋白（作者将90个克隆进行了分析并列表，详见原文）。为了进一步排除假阳性的相互作用，作者将选取了15%的阳性克隆，提取质粒，再次转化进入原始酵母菌株中验证了相互作用。这篇文章利用了多种方法筛选了与Hsp90相互作用的蛋白，酵母双杂交只是其中之一。它被用来全面筛选寻找与Hsp90在生理上相互作用的蛋白。作者采用了多种方式来降低系统的假阳性率并提高系统可靠性，如利用Gal4空质粒作为系统阴性对照，增加筛选次数排除假阳性，使用高浓度3-AT来降低His3报告基因的背景等，并且作者对Hsp90也进行了分段筛选，从而确定了目的蛋白与Hsp90相互作用的区段（多数目的蛋白与Hsp90的中间段和C端相互作用）。

酵母双杂交系统作为成熟的研究蛋白-蛋白相互作用的系统之一，之所以得到如此广泛的应用，必然具有其自身的优点。首先，该方法成本相对较低，对实验室的要求也不高，只要具备基本的微生物培养条件的实验室都可以开展相关的研究。其次，能够同时筛选鉴定多个与已知蛋白相互作用的未知蛋白。在质谱技术等高通量蛋白质组技术成熟以前，该方法是大批量筛选相互作用蛋白的首选方法之一。第三，酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的相互作用，具有高度敏感性。主要是由于蛋白在酵母细胞中都是过量表达的，并且它是通过高敏感度的报告基因（如β-半乳糖苷酶）进行最终结果检测的，最终的结果经过了多步的级联放大作用，因此一些较弱的瞬时相互作用系统也能检测出来。

（四）技术局限性

任何一个系统都具有其自身的局限性，酵母双杂交系统也是如此，有一些问题必须在实验前充分考虑，从而避免不必要的麻烦和人力物力及时间的浪费。

1．系统假阳性率较高 做过酵母双杂交筛选的研究者都有一个共同的感受，就是进行酵母双杂交筛选相互作用蛋白时，往往具有较高的假阳性率。这与酵母双杂交系统本身的特性是密切相关的。首先，如前所述，酵母双杂交系统的敏感性较高，经过了多步级联放大作用，因此一些很弱的相互作用利用其他试验方法可能得不到验证。其次，在酵母双杂交系统中，bait蛋白和prey蛋白（包括胞浆蛋白、各种细胞器蛋白、核蛋白等）都需要进入细胞核中，在不同组织不同细胞表达的以及在不同发育时期表达的蛋白在酵母双杂交系统中同时同地获得了表达，这样就打破了各种蛋白表达的时空和物理间隔，容易形成假的相互作用。因此，在初步筛选得到大量候选的相互作用蛋白后，一定要详细阅读相关文献，分析bait蛋白与筛选到的相互作用的蛋白在组织表达谱、亚细胞定位和表达时间是否存在重叠，功能上是否相关，从而直接排除一些可能是假阳性的蛋白。

这里，研究者归纳了若干酵母双杂常见的部分假阳性蛋白：hsp’s；ribosomal proteins；cytochrome oxidase；mitochondrial proteins；proteasome subunits；ferritin；tRNA synthase；collagen-related proteins；Zn finger proteins；vimentin；inorganic pyrophosph；elongation factors；lamin；cytoskeletal proteins；ubiquitin等。

2．很多蛋白不适用于酵母双杂交系统 如前所述，很多蛋白并不适用于酵母双杂交系统。很多膜蛋白，即使加上入核信号，也可能不能顺利入核或是入核后不能正确折叠。另外，高等真核生物的蛋白翻译后修饰要比酵母复杂得多，因此，一些需要复杂修饰的蛋白如果在酵母中不能正确修饰，就不能正确折叠，从而也不适合酵母系统。还有一些蛋白的活性受到共价修饰的调节，如很多蛋白在磷酸化后才成为有活性的形式，而这些蛋白在酵母系统中如果缺乏相应的磷酸化修饰，就不能通过酵母双杂交筛选得到与其活性形式相互作用的蛋白。最后，一些具有转录活性的蛋白不适合酵母双杂交系统，这些蛋白由于自身就具有转录激活的特性，与DNA结合结构域融合后，就能够直接激活报告基因的表达，就不能进行下一步的筛选试验了。在这些情况下，就需要根据实际情况选用合适的酵母双杂交系统（目前有多种酵母双杂交系统可供选择），如果酵母双杂交系统不合适，就必须考虑采用其他的蛋白相互作用的研究方法。