酵母双杂交技术

实验三十一　酵母双杂交技术

【实验目的】

1.掌握酵母双杂交实验的原理。

2.学习应用酵母双杂交实验验证蛋白质之间的相互作用。

【实验原理】

酵母双杂交系统，又称蛋白捕获系统，是由Fields和Song等人根据真核转录调控的特点创建的。真核生长转录因子含有两个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA binding domain，BD)和DNA转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。BD识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节基因的上游; AD与转录复合体其他成分作用，从而启动所调节基因的转录。二者连接区在适当部位打开，可使BD与AD分离，而且两结构域可重建转录因子发挥转录激活作用。将拟研究的靶蛋白(prey)基因与AD序列结合，编码另一蛋白——诱饵蛋白(bait)的基因与DNA的BD序列结合，形成两段融合基因。在构建融合基因时，靶蛋白或诱饵蛋白与结构域基因必须在阅读框架内融合(不破坏各自的密码子)。当这两段融合基因在同一菌株内表达，靶蛋白与诱饵蛋白在核内相互作用时，才能重新形成一个完整的有活性的转录因子，从而激活报告基因的转录。所以根据报告基因表达与否，即可判断靶蛋白与诱饵蛋白之间是否作用。该系统中常用的两个质粒如图3-21所示。

图3-21　酵母双杂交中使用的质粒

酵母双杂交技术应用于检验蛋白质间的相互作用、分析蛋白质相互作用的结构域以及发现新的作用蛋白质。在研究特定的基因功能、信号传导、代谢途径中，蛋白质相互作用的关系网络的研究发挥着重要的作用。

常规的酵母双杂交实验对于检测膜蛋白的相互作用有局限性，一种可用于膜蛋白的酵母双杂交系统USPS(ubiquitin-based splitprotein sensor)应运而生(Fashena et al.，2000)。

【实验材料】

1.菌株: E. coli DH5α，Y1090，DH10B。

2.酵母双杂交系统: MATCHMAKER Two-Hybrid System 3试剂盒购自CLONTECH公司。包括GAL4 DNA结合域表达载体pGBKT7，带有Kan抗性和Trp选择标记; GAL4 DNA激活域表达载体pGADT7，带有Amp抗性和Leu选择标记;自激活阳性对照质粒pCL1，带有Amp抗性和Leu选择标记;自激活阴性对照质粒pGBKT7-lam，带有Kan抗性和Trp选择标记(图3-21)。酵母菌株AH109，酵母菌株Y187。

【药品试剂】

1. LB培养基。

2. YPD: 20g Difco peptone，10g Yeastextract，调pH值至5.8，加超纯水定容至950 ml，高压灭菌，之后加入灭菌的40%葡萄糖50 m l。YPDA培养基中另加0.2% Ade(adenine腺嘌呤)。固体培养基含Agar 20g/L。

3. SD/-Trp: 0.74g DO/-Trp，6.7g YNB，以NaOH调pH值至5.8，加超纯水定容至950 ml，之后加入灭菌的40%葡萄糖50 ml。固体培养基含琼脂粉20g/L。

4. SD/-Leu: 0.69g DO/-Leu，6.7g YNB，以NaOH调pH值至5.8，加超纯水定容至950 ml，之后加入灭菌的40%葡萄糖50 ml。固体培养基含琼脂粉20g/L。

5. SD/-Trp-Leu: 0.64g DO/-Trp-Leu，6.7g YNB，以NaOH调pH值至5.8，加超纯水定容至950 ml，之后加入灭菌的40%葡萄糖50 ml。固体培养基含Agar 20g/L。

6. SD/-Trp-Leu-His-Ade: 0.6g DO/-Trp-Leu-His-Ade; 6.7g YNB以NaOH调pH值至5.8，加超纯水定容至950ml，之后加入灭菌的40%葡萄糖50ml。固体培养基含琼脂粉20g/L。

7.酵母转化使用液:

10×TE buffer: 0.1 mol/L Tris·Cl，10 mmol/L EDTA，pH 7.5。

10×LiAc: 1mol/L LiAc，用醋酸调pH值到7.5。

50% PEG3350:取50g PEG3350溶于60 ml超纯水中，加热溶解，定容到100ml。

以上溶液高压灭菌。

8.酵母裂解液: 2% Triton X-100，1% SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA。

9.β-半乳糖苷酶活性检测所用试剂:

Z buffer: 16.1g/L Na₂ HPO₄·7H₂O，5.50g/L NaH₂ PO₄·H₂ O，0.75g/L KCl，0.246g/L MgSO₄·7H₂ O，调pH值至7.0，高压灭菌。

X-gal储存液:以DMF为溶剂溶解X-gal配成50mg/ml的溶液，－20℃条件下避光保存。

Z buffer/X-gal溶液: 100ml Z buffer，0.27 m lβ-巯基乙醇，0.668 mL X-gal储存液。

【实验方法】

一、载体构建

将编码待检测蛋白的基因分别构建到pGBKT7和pGADT7上(方法参见分子生物学实验)。

二、自激活实验

以酵母菌AH109为受体菌，采用LiAc法分别转化自激活阳性对照质粒PCL1、阴性对照质粒pGBKT7-lam、诱饵蛋白重组质粒pGBKT7-gene。将转化的菌体分别涂布相应的SD-Leu或SD-Trp平板，生长2～3天，分别挑取酵母转化子至SD-His平板做组氨酸营养型检测或至滤纸片上，进行β-半乳糖苷酶活性检测。含有pCLl的转化子在很短的时间内变为蓝色，含有pGBKT7-lam和pGBKT7-gene的转化子在8小时之内没有颜色改变。而在SD-His平板上，除了PCL1转化子外，其他菌株都不能生长，这一结果表明待测基因没有自激活特性，可以作为诱饵蛋白进行。

三、酵母感受态细胞的制备和LiAc介导的质粒DNA转化

1.挑取几个直径2～3mm的酵母克隆至5ml YPD或SD培养基中，30℃，200r/min过夜培养。

2.将其转接到含有50mL相应的培养基中，30℃培养3～5小时，室温条件下，1000r/min离心5分钟收集菌体，弃上清液。

3.沉淀加入25～50m l灭菌水重悬，室温，1000g离心5分钟，弃上清液，以新鲜配制的1×TE/LiAc溶液(体积比10×TE: 10×LiAc: H₂ O= 1∶1∶8)重悬细胞沉淀，即制成酵母感受态细胞。

4.在1.5ml离心管中加入0.1μg质粒DNA和1μg鲑精DNA(鲑精DNA使用前用沸水煮10分钟后快速置于冰浴)，混匀。

5.加入0.1m l酵母感受态细胞，混匀，再加入0.6 m l灭菌的PEG/LiAc溶液(体积比10×TE∶10×LiAc∶50% PEG4000= 1∶1∶8)，高速振荡10秒以混匀。

6.之后，30℃条件下，200r/min培养30分钟，加入70μl DMSO，42℃水浴热击15分钟，再置于冰上冷却1～2分钟，14000r/min室温离心5秒钟，去上清液。

7.沉淀用200μl灭菌水重悬后涂布带有相应选择标记的缺失平板上，30℃倒置培养。

四、报告基因的检测

1.LacZ报告基因的检测:采用β-半乳糖苷酶活性检测:将在缺失平板上生长的酵母菌落用无菌牙签挑到一张干净的滤纸上，菌落面朝上，置于液氮中10秒，室温解冻后，将滤纸放入事先浸泡于Z buffer/X-gal溶液中的另一张干净的滤纸上，30℃孵育，观察菌落是否出现蓝色，以8小时之内出现蓝色为阳性，没有颜色变化的为阴性。

2.His3报告基因的检测:将生长的酵母克隆，用无菌牙签画线转接于不含His C(SD/His)的营养缺陷型平板上，30℃培养3～4天，观察菌落生长情况。

3.Ade2报告基因的检测:将生长的酵母克隆，用无菌牙签画线转接于不含Ade(SD/Ade)的营养缺陷型平板上，30℃培养3～4天，观察菌落生长情况。

【思考题】

1.酵母双杂交的原理如何?

2.酵母双杂交实验有哪些优缺点?