酵母的分离与鉴定

实验五　酵母RNA的分离与鉴定

【实验目的】

1．了解并掌握稀碱法提取RNA的基本原理及具体方法。

2．了解RNA的化学组成及定性鉴定的原理与操作过程。

【实验原理】

由于RNA的来源和种类很多，因而提取方法各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中。DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA及蛋白质，提取的RNA具有生物活性。

工业上制备RNA多选用成本低，适于大规模操作的稀碱法及浓盐法。用发酵工业的下脚料如酵母、白地霉如青霉菌菌丝体等提取RNA，其得率常为菌种重量的3%～5%。而DNA含量仅为0．03%～0．52%，因此提取RNA多以酵母为原料。稀碱法是用氢氧化钠溶液，使细菌细胞壁变性，浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。用稀碱使酵母细胞裂解后，用酸中和，然后除去菌体，用乙醇沉淀上清液中的RNA或将pH值调至RNA的等电点(pH2．5)，使蛋白质沉淀出来。

RNA是生物高分子化合物，进一步水解可生成磷酸、戊糖和碱基。各种组分可用下述方法鉴定:

1．磷酸与钼酸铵试剂作用能产生黄色的磷钼酸铵［(NH₄)₃PO₄·12MoO₃］沉淀。

2．核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。

3．嘌呤碱与硝酸银产生白色的嘌呤银化合物沉淀。

【实验器材】

离心机、布氏漏斗、抽滤瓶、石蕊试纸、漏斗、表面皿。

【药品试剂】

1．干酵母粉。

2．0．2%氢氧化钠溶液。

3．乙酸、乙醚、95%乙醇、1 mol/L氨水、10%硫酸。

4．0．1 mol/L硝酸银溶液。

5．钼酸铵试剂:将2 g钼酸铵溶解在100 ml 10%硫酸中。

6．地衣酚试剂:100 ml浓盐酸中加入100 mg三氯化铁，摇匀，储存备用。使用前加入476 mg地衣酚(甲基苯二酚)。

【实验方法】

1．酵母RNA提取:

(1)称4 g干酵母粉置于100 ml烧杯中，加入40 ml 0．2%氢氧化钠溶液，沸水浴上加热30分钟，不断搅拌。

(2)加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性(石蕊试纸检查)，4000 r/min，离心10～15分钟。

(3)取上清液，加入30 ml 95%乙醇洗2次，每次用10 ml。

(4)用无水乙醚洗两次，每次10 ml，洗涤时可用小玻棒小心搅动沉淀。

(5)用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。

(6)称量所得RNA样品重量，计量得率:

2．RNA组分鉴定:

(1)水解RNA:向锥形瓶中加入少量(0．1～0．2 g)酵母RNA和10%硫酸溶液15 ml。在瓶口上插一玻璃小漏斗，漏斗上盖上表面皿，然后在沸水浴中加热水解约30分钟，过滤，取滤液进行下列试验。

(2)嘌呤碱基的检查:取试管一支，加入1 ml 0．1 mol/L硝酸银溶液，再逐滴加1 mol/L氨水至沉淀消失。然后加入1 ml滤液，放置片刻，观察有无嘌呤碱基的银化合物沉淀产生(沉淀见光变为红棕色)。

(3)磷酸的检查:取2 ml滤液放入1支试管中，加入5滴硝酸银和1 ml钼酸铵溶液后，在沸水中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。

(4)戊糖的检查:取一支试管，加入1 ml滤液，然后加入2 ml地衣酚试剂，摇匀后在沸水浴上加热10～15分钟，观察颜色的变化。

【注意事项】

1．稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。

2．脱氧核糖及核糖均可与地衣酚反应。因此地衣酚试验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。

【思考题】

1．在酵母RNA的提取实验中，95%乙醇有什么作用?

2．若要鉴定DNA水解液的组分，应如何安排试验?

3．现有三瓶未知溶液，已知它们分别为蛋白质、糖和RNA，采用什么试剂和方法对这三种溶液进行鉴定(自行设计简便的实验)?