结构模型的实验证明

沃森、克里克提出的DNA的双螺旋结构模型，很好地解释了X射线衍射分析资料和关于DNA的生化分析实验数据，为阐明DNA复制的精确性和信息的多样性奠定了结构基础，开创了分子遗传学，这个模型被誉为“金螺旋”。然而，DNA真是这样的吗？DNA是不是真的通过碱基专一性配对来复制的呢？实际上DNA双螺旋模型此时还只是一种科学假设，它需要实验的验证。爱因斯坦（A.Einstein）有句名言，他说：“证实一个理论假设的最困难的任务是，你必须把这个理论的推论发展到使它们成为在经验上可检验的地步。”

DNA结构模型提出后不久，美国华盛顿大学的科恩伯格（A.Kornberg）分离到了细菌的一种复合酶。这种酶能催化DNA的合成，但必须以一段自然的DNA为模板，新合成的DNA分子则是自然的DNA复制品，两个DNA分子的结构是一模一样的。科恩伯格称这种酶为DNA多聚酶，后来的研究表明，科恩伯格当时分离到的酶并不是自然条件下的DNA复制酶，而是具有损伤修复功能的一种DNA多聚酶。正是这个酶，在1958年被芝加哥大学的研究生梅塞尔森（M.Meselson）和加州理工学院的青年研究人员斯塔尔（F.Stahl）用来做了一个证实DNA分子的互补性和复制的半保留性的实验。冷泉港研究所所长凯恩斯（J.Cairns）称这个实验是“生物学中最漂亮的实验”。

梅塞尔森和斯塔尔先设想DNA的复制到底有多少种可能的方式，他们认为应该有三种可能性（图1-17）。第一种可能的复制方式就是沃森和克里克说的半保留复制模式（semiconservative model），即复制时母分子的两条链分开，各自以自己为模板来合成子链DNA，这两条子链的DNA碱基序列跟母链是完全一样的。为什么叫半保留呢？因为每个子分子各保留了一条母链，再加上一条新合成的子链。经过第二次复制后，产生四个子分子，其中有两个分子含有一条第一代的母链，另外两个子分子不再含有第一代的母链。第二种可能的复制方式是全保留复制模式（conservative model），即复制时母分子的两条链不拆开，而是以整个双链分子为模板来合成一个全新的子分子，经过第二次复制后，产生的四个子分子中，其中有一个分子保留了两条母链，另外三个子分子全都由新链组成。第三种可能的复制方式是母分子的双链完全打开，并降解为核苷酸，再重新合成为DNA分子，称为裂解重建模式（dispersive model），但每个分子中都包含来自母分子的一部分核苷酸，经过第二次复制后，产生的每个子分子中仍然含有母分子来源的核苷酸，但从理论上讲，比例会比上一代降低一半。

图1-17　DNA复制的三种可能模式（引自D.T.Suzuki）

（a）半保留复制；（b）全保留复制；（c）裂解重建型复制

要证实三种复制方式中哪一种是符合实际的，必须要能区分参与复制的各种DNA分子，即在实验中准确辨明在各种复制模式中，母分子是什么样子的，第一次复制后的分子是什么样子的，第二次复制后的分子是什么样子的。一般来说，在生物合成研究中最常用的技术是放射性同位素标记技术。例如，要了解新合成的未知蛋白质是否含有某种特定的氨基酸，就可以用放射性同位素将合成反应底物中的这种氨基酸加以标记，合成反应完成后，如果新合成的蛋白质有放射性，则可以判定它含有这种氨基酸；反之，如果新合成的蛋白质没有放射性，则可以判定它不含有这种氨基酸。但是，用放射性同位素标记方法却不能区分通过不同模式复制的DNA分子，因为无论采用哪种模式复制的DNA分子，理论上都会有通过不止一种合成途径的分子被标记，而标记上放射性同位素的DNA分子也就不能准确辨明其合成的具体模式了。如何用实验方法来区分这几种结构相同但复制途径全然不同的分子，是年轻的梅塞尔森和斯塔尔要解决的问题。

尽管他们知道在一般的生化分析中，区分结构相同但合成途径不同的代谢物的最有效方法也是放射性同位素标记法。但是这种放射性标记技术在区分DNA复制模型上是无能为力的。试想如用放射性磷来标记原始的DNA分子，则由三种模型中得到的子分子，是既无法分离也无从区别的，即使能将被放射性磷标记的分子与未被标记的分子分开，至少还有三种分子因为都携带了放射性磷而不能进一步区分。

梅塞尔森和斯塔尔放弃了这一条路，而设计了用非放射性的重元素标记与密度梯度离心技术相结合的方法来区分和鉴别四种不同的DNA分子。

根据阿基米德原理，物体在液体中的浮力等于它排开的液体的重量。梅塞尔森和斯塔尔发现，浓度为6 mol/L的氯化铯溶液的密度与DNA分子相当，DNA分子在这样的溶液中能处于刚刚浮起来的状态。他们把6 mol/L的氯化铯溶液做每分钟旋转45 000次的超离心，产生相当于140倍重力加速度（g）的离心力。离心30h后，氯化铯溶液中的离子会沿着离心管纵轴形成一个密度梯度。这时溶液中的DNA分子会集中在一个与分子密度相等的液层内，离心管中比这个液层更接近管底的液层具有比DNA分子更大的密度，这时浮力就会将DNA分子推向管子上部；反之，密度较小的上层液层产生的浮力也较小，DNA分子又会被压向管底方向，DNA分子会在达到平衡时稳定地集中在与自身密度相等的液层。如果有两种或多种比重不同的DNA分子，则会在建立了密度梯度的氯化铯溶液中分别集中于两个或多个不同的液层内。基于这样的设想，可以先把大肠杆菌放在含有重氮15N标记氯化氨的培养基中连续培养14代，让所有的DNA基本上都被15 N标记，这时DNA分子的两条链都成了重链，把它定义为亲代分子。然后把亲代细菌放在含有一般的氮元素，即14N的氯化氨培养基里培养，细菌繁殖一代后，它的DNA也复制了一次。然而，经历了不同方式复制的DNA分子所携带的15N和14N的数量是不一样的（图1-18）。第一种，如果是借助半保留复制模式复制的两个子分子都应该有一条链是含15N的重链，一条链是含14N的轻链，所以它们的密度介于重链和轻链之间。第二种，如果是借助全保留复制模式复制的，复制一代后的两个子分子中，应该有一个分子的两条链都是含15N的重链，而另一个分子的两条链都是只含14N的轻链，所以经过一次复制后产生的两个分子的密度是不一样的。第三种，如果是借助裂解重建模式复制的，两个子分子都应该含有15N和14N，密度会大致相当，但由于两种氮元素的参入是随机的，两个子分子的密度不会绝对相等。这就是根据不同的理论模型对各种复制模式所生成的子一代分子间密度差异的预测。

如果让增殖了一代的大肠杆菌在含14N的氯化氨培养基里继续培养，细菌再繁殖一代后，它的DNA分子也会再复制一次，就会产生子二代分子。借助半保留复制模式复制的四个子二代分子中，只有两个分子中含有一条重链和一条轻链，其密度应该与子一代分子的密度相同，另外两个子分子都应该只含有两条轻链，经超离心可以把这两种子二代分子区分开，并且两种分子的数量相等。而借助全保留复制模式复制的四个子二代分子中，仍然有一个子分子由两条重链组成，另外三个都由轻链组成，经超离心也可以把这两种子二代分子区分开，这两种分子的数量比是1∶3。要是借助裂解重建模式复制，则四个子二代分子的每一个分子中都应该包含来自母分子的含有15N的核苷酸，但经过第二次复制后，子二代分子中来源于母分子的核苷酸数量会进一步减少。从理论上讲，比例会比上一代降低一半。这些是根据不同的理论模型对各种复制模式所生成的子二代分子间密度差异的预测。

那么，梅塞尔森和斯塔尔的重氮标记实验是怎样证实沃森和克里克提出的半保留复制模式的呢？

梅塞尔森和斯塔尔的实验步骤如下。

（1）以在含重氮15N的氯化氨（15NH4Cl）培养基中连续培养大肠杆菌14代后得到的重氮标记细菌作为实验的起始菌群，其DNA分子中的氮几乎都已是15N

（2）将实验细菌群体的样品离心并冷冻保存。

（3）用超量的只含14N的氯化氨配制的培养基培养实验细菌。

（4）根据实验设计要求定时取样，离心沉淀和冷冻保存。

（5）以一直在不含15N的培养基中生长的细菌为对照，与实验组同时取样，沉淀和冷冻保存。

（6）分别破碎每个样品的细菌，提取DNA，将在细菌培养的不同时间取样所获得的亲代分子、子一代分子和子二代分子放在浓度为6 mol/L的氯化铯（CsCl）溶液中，这种浓度的氯化铯溶液，在以每分钟旋转45 000转的速度在离心机中离心30 h后，最后用紫外光作光源摄下各种DNA在离心管中的位置。梅塞尔森和斯塔尔得到的亲代分子、子一代分子、子二代分子在离心管中的分布完全符合半保留复制模式，从而证实了沃森和克里克提出的碱基专一性配对和半保留复制模式是正确的。全保留复制和裂解重建式复制的可能性被完全排除。

有趣的是这个在1958年发表的实验和克里克在1957年的预言完全一样：“DNA的两股链互相紧密吻合，如同一只手被套在一只手套里，当它们以某种形式分开后，这只手就是另一只手套的模子，而这只手套则是另一只新的手的模子。这时我们有了两只戴了手套的手，而在这以前，我们只有一只。”这样，DNA分子结构模型和复制模型完全确立了。在梅塞尔森写给沃森的一封信里有两句诗：“那是非常神秘的重氮，结束了沃森克里克的摇摆。”沃森-克里克模型在这个实验前还是一个猜想，他们还在“摇摆”。正是梅塞尔森和斯塔尔使用了神秘的重氮验证了沃森-克里克模型。

梅塞尔森和斯塔尔的实验的确做得很漂亮，然而，要是能通过实验把子一代杂合子分子拆分开，证实它的确由一条重链和一条轻链组成就更有说服力了。1962年，马默（J.Marmur）等做了重链和轻链杂合的DNA分子的拆合实验。将密度为1.717g/cm3的杂合分子解离为密度为1.740g/cm3的只含15N的重链和密度为1.725g/cm3的只含14N的轻链（DNA双链的密度要比单链的小），然而再将重链和轻链复性为密度为1.717g/cm3的杂合分子，马默的实验把梅塞尔森和斯塔尔的实验又推进了一步。对这个结果可不可以进一步质疑呢？能不能把DNA复制的实验做得再漂亮一点呢？实际上，梅塞尔森和斯塔尔以及马默等所研究的大肠杆菌DNA分子已经在实验中被切割成许多小的片段，他们的实验所提供的信息只涉及DNA在复制前和复制后的两种状态，并从这两种状态推论出DNA的复制模式。第一次真正观察到正在复制中的DNA的是凯恩斯，他在1963年拍摄到正在复制的大肠杆菌DNA（图1-19）。这张照片是非常经典的，凯恩斯看到了大肠杆菌的染色体是一个封闭的环状DNA分子，复制中形成的两个复制叉之间的DNA片段由一条母链和一条子链组成，这标志着在活细胞中找到了DNA半保留复制的证据。1962年，沃森和克里克因发现DNA分子结构，与改进了X射线衍射技术的威尔金斯一起获得了诺贝尔生理学或医学奖。1974年，克里克在回忆这段经历时十分感叹地说：“与其相信沃森和克里克构建了DNA结构，我更愿强调正是这个有着科学家风格的分子结构造就了沃森和克里克。”

图1-18　用重氮标记与密度梯度离心法证实DNA半保留复制的实验结果示意（引自D.T.Suzuki）

图1-19　正在复制中的大肠杆菌DNA（引自J.Cairns）

（a）放射性磷标记后的电镜照片；（b）电镜照片的诠释图

DNA复制是从染色体的一个特定的核苷酸序列开始的，这个序列称为复制起始点。复制是双向进行的，所以，在复制过程中可以看到典型的复制叉结构。在每个复制叉上由螺旋酶解开双螺旋，然后单链结合蛋白将分开的单链稳定。同时，拓扑异构酶使复制叉侧翼邻接区段解旋，继后出现的超螺旋区段在产生裂隙后重新连接，以保证复制叉向前推进。DNA复制叉形成时，需要一段与复制起始区段互补的短RNA作复制引物，这段引物由DNA引发酶合成。随之DNA多聚酶在引物的3′端逐一接上与模板DNA链互补的核苷酸。复制叉中的两条链，有一条是从5′端向3′端连续合成的，称为前导链；另一条称为后随链，这条链通过一个一个称为冈崎片段（Okazaki fragment）的小片段逐节合成，这些冈崎片段最后由连接酶连成长链。整个复制过程如图1-20。在复制过程中，DNA多聚酶除了从5′→3′的合成作用外，还有对合成过程中错误参入的核苷酸从3′→5′的水解切除作用。DNA多聚酶的这种校正功能从合成机制上保证了复制的高度精确性。

图1-20　DNA复制过程示意

为了探索DNA复制的具体途径，科学家们研究了与复制有关的种种生化反应，以及各种相关的酶系和辅助因子；提出多个假设来说明DNA解旋的拓扑学问题，研究DNA合成的方向和合成速率的调控机制，还有原核生物和真核生物DNA合成的具体细节。这方面的研究还没有完结，人们对DNA复制，即它的自体催化的研究还在不断深入。