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复制的基本特点

时间:2022-10-20 百科知识 版权反馈
【摘要】:目前已知参与松弛螺旋及解链的酶与蛋白质主要有拓扑异构酶、解链酶及DNA单链结合蛋白。碱基顺序相同但连环数/拓扑环绕数不同的两个双链DNA分子称为拓扑异构体。作用结果使分子内张力释放,DNA解链旋转时不至于缠结。在DNA复制时,Rep蛋白与某种解链蛋白分别在两条DNA亲链上协同作用,使DNA双链得以解开。SSB还能与复制新生的DNA单链结合,以保护其免被核酸酶水解。新合成的两个DNA分子和亲代DNA分子是完全一样的。
复制的基本特点_医学分子生物学

Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构时指出,双螺旋的每一条DNA链都可以作为模板合成一条与其互补的DNA链,从而形成两条与其完全相同的子链(图3-1)。但是有两个问题他们在当时尚无法回答:①在复制过程中DNA双螺旋如何解旋将双链打开;②在复制过程中DNA的两条链是否同时作为模板复制子链。1958年Matthew Meselson和Franklin Stahl通过实验对后一个问题给予了一个满意的解答,而人们对第一个问题的真正了解却是在拓扑异构酶的发现之后。

(一)DNA双链的解旋

根据Watson和Crick的DNA双螺旋模型以及他们对DNA作为复制模版的推测,人们首先提出的问题是:DNA分子只有在松弛螺旋、解开双链、使碱基暴露后,才能在DNA聚合酶催化下以DNA为模板按碱基互补的原则进行复制。那么,在复制过程中DNA双螺旋如何解旋将双链打开?按照每10个碱基一个螺旋推测,仅仅一条人的染色体DNA就有几百万甚至几千万次螺旋。很难想象在DNA进行复制时这些螺旋如何打开。为此人们在最初甚至对DNA双螺旋的模型发生质疑。1954年Delbrück首次提出“断裂-连接”模型(breakage-and-reunion model),试图解释DNA双螺旋的解旋过程。但是直到20世纪70年代末拓扑异构酶被发现之后,人们才对这一过程具有了真正的了解。目前已知参与松弛螺旋及解链的酶与蛋白质主要有拓扑异构酶、解链酶及DNA单链结合蛋白。

1.拓扑异构酶 DNA具有拓扑性质。拓扑性质是指物体或图像作弹性移动而又保持物体不变的性质。碱基顺序相同但连环数/拓扑环绕数不同的两个双链DNA分子称为拓扑异构体。能催化DNA拓扑异构体互变的一类酶称为拓扑异构酶(topoisomerase,topo)。拓扑异构酶可分为两类,一类是拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)(图3-2,图3-3),另一类是拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)。

(1)拓扑异构酶Ⅰ:原核生物TopoⅠ能使负超螺旋松弛。其作用机制是:①切断DNA双螺旋中的一股,酶与DNA断端结合形成磷酸酪氨酸键;②互补链通过缺口;③断端连接,使双股的单环DNA转变成松弛的双链环。作用结果使分子内张力释放,DNA解链旋转时不至于缠结。TopoⅠ催化的反应不需要ATP。

(2)拓扑异构酶Ⅱ:TopoⅡ又称解旋酶(gyrase),有两个a亚基和两个b亚基。a亚基具有磷酸二酯酶活性,b亚基具有DNA依赖的ATP酶活性。TopoⅡ在无ATP时,切断处于超螺旋状态DNA分子某一部位的两条链,未断的DNA双链穿过缺口,使超螺旋松弛;有ATP时,水解ATP提供能量,已松弛的DNA分子转变为负超螺旋,增加超螺旋的稳定性。此外TopoⅡ还具有环连或解环连,以及打结和解结的作用。

2.DNA解链酶(DNA helicase) 其作用是解开DNA双链,需要有ATP为能源。解链酶有多种,包括大肠埃希菌解链酶Ⅱ、Ⅲ,大肠埃希菌Rep蛋白等。复制时大部分解链酶可以沿着随从链的模板以5′→3′方向随复制叉的前进而移动,并连续地解开DNA双链。只有Rep蛋白是沿着前导链的模板以3′→5′移动。Rep蛋白在初发现时被称为复制蛋白Rep,后来发现它在有ATP存在时能解开DNA双链,每解开一对碱基,需消耗两分子ATP,因而又定名为解链蛋白。在DNA复制时,Rep蛋白与某种解链蛋白分别在两条DNA亲链上协同作用,使DNA双链得以解开。

图3-1 Watson和Crick预测的DNA复制模型

亲代双螺旋的多聚核苷酸由黑色表示,都作为DNA新链(由浅色表示)合成的模板。这些新链同模板链以碱基配对的方式决定其序列。拓扑学问题的产生是因为亲代螺旋的两条多聚核苷酸链不能轻易地被拉开;螺旋必须通过某种方式来解旋

图3-2 拓扑异构酶Ⅰ作用模式

拓扑异构酶Ⅰ在DNA分子的一条链上制造一个缺口,使完好的那条链通过缺口,然后修复缺口

图3-3 DNA拓扑异构酶将双螺旋解旋

复制过程中,DNA拓扑异构酶将双螺旋“解旋”,因此复制叉就可以沿分子继续前进而不需要转动螺旋

3.DNA单链结合蛋白(single strand DNA binding protein,SSB) 在原核和真核细胞中均有发现,它能与解链酶解开的DNA单链紧密结合,维持单链状态,以利于其发挥模板作用。SSB还能与复制新生的DNA单链结合,以保护其免被核酸酶水解。SSB在复制过程中,可以循环利用,发挥其保护单链DNA的作用。

(二)DNA半保留复制

在DNA双螺旋结构模型提出以后,关于DNA复制方式有几种不同的推测(图3-4)。一种是在上述的“断裂-连接”模型的基础之上提出的弥散式复制(dispersive replication)方式。Delbrück在试图解释DNA双螺旋的解旋过程时提出了这一模型。但是根据这一模型推测出的DNA复制方式,得到一种非常复杂的结果:DNA的每一条子链的一部分由新合成的DNA组成,而另一部分由模板链组成。也有人把这种模式称为混合性复制。

图3-4 DNA复制的三种可能途径

为清楚显示,DNA分子使用梯状而非双螺旋表示

Watson及Crick提出DNA双螺旋结构模型时,曾推测在DNA复制时,DNA双链中的互补碱基之间的氢键断裂,解开为两条单链,每一条单链都可以作为模板,按碱基互补原则合成互补链。新合成的两个DNA分子和亲代DNA分子是完全一样的。在子代分子中各有一条单链来自亲代,另一条链是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semi-conservative replication)。对DNA复制方式的第三种推测是,仍然是以亲代的每一条链为模板合成一条新链,但在组成两个子代分子时,一个子代分子完全是亲代的两条旧链组成,而另一个子代分子则由新合成的两条新链组成,这种方式称为全保留复制(conservative replication)。

1957年,Meselson和Stahl通过实验证实了半保留复制的模式(图3-5)。他们以大肠埃希菌作为实验材料。大肠埃希菌可以利用NH4Cl作为氮源合成DNA。把细菌放在以15 N标记的NH4Cl为唯一氮源的培养基(重培养基)中培养15代(每一代20~30min),分离出的DNA是含15 N的“重”DNA,然后将细菌转移到含有14 N标记的NH4Cl作为唯一氮源的培养基(轻培养基)中培养,新合成的DNA将有14 N的掺入。在培养的不同时间收集细菌、提取DNA进行CsCl密度梯度离心分析。实验结果表明,细菌在重培养基中生长繁殖时合成的(15 N)DNA显示为一条重密度带;转入轻培养基中繁殖两代,在第一代时得到一条中密度带,提示其为(15 N14 N)DNA的杂交分子;在第二代时可见中密度带和低密度带两个区带,表明它们分别为(15 N14 N)DNA及(14 N14 N)DNA。随着在轻培养基中培养代数的增加,低密度带增强,而中密度带保持不变。这一实验结果符合半保留复制方式。证实第一代杂交分子确实是(15 N14 N)DNA,将杂交分子经100℃加热变性,再对变性前、后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。结果变性前为一条中密度带,变性后则分为两条带,即重密度带和轻密度带。说明杂交分子中一条为15 N-DNA链,另一条为14 N-DNA链,进一步证实了DNA的半保留复制。

由于DNA分子中两股单链有碱基互补的关系,所以由一股链可以确定其对应链的碱基序列,遗传信息按这种方式忠实地从亲代传给子代。

图3-5 Meselson-Stahl实验

A.Meselson-Stahl实验操作:在含有15 NH4Cl(用氮的重同位素标记的氯化铵)的培养基中培养大肠埃希菌。然后将细菌转移到正常培养基中(含14 NH4Cl),分别在20min(一次细胞分裂)和40min(两次细胞分裂)后取样,并从样品中提取DNA进行密度梯度离心分析。20min后的DNA样品具有相似的15 N、14 N的含量;而40min后的样品就能看到两条带,一条相当于14 N-15 N-DNA杂交带,另一个DNA分子完全由14 N组成。B.根据DNA复制三种可能的方式所推测的实验结果。20min后所看到的带形排除全保留复制方式。因为按这种理论,经过一轮复制,应该得到两种不同的双螺旋,一种只含有15 N,而另一种只含有14 N。20min后实际见到的14 N-15 NDNA杂交带与弥散复制和半保留复制一致。但40min后所见到的两条带就只与半保留复制一致。而弥散复制在两轮复制后仍应生成14 N-15 N杂交分子,而半保留复制在这个阶段所合成的分子包括两个完全由14 N-DNA所组成的分子

(三)复制叉和DNA的半不连续复制

当DNA进行复制时双螺旋链打开,新链沿着张开的模板生成,形成一种Y字形的结构,称为复制叉(replication fork)。DNA双螺旋的两条链是反向平行的,一条是5′→3′方向,另一条是3′→5′方向,两条链都能作为模板合成新的互补链。DNA合成的方向似乎是一条为3′→5′,另一条是5′→3′。但是,生物体内所有DNA聚合酶的催化方向都是5′→3′,在复制过程中DNA聚合酶以3′→5′方向的DNA模板链为模板,随着复制叉移动的方向,连续合成新的互补链,称为前导链(leading strand)。但是DNA聚合酶不能随着复制叉移动方向合成另一条模板链的互补链。另一条模板链是如何合成的呢?1968年在美国的日本学者冈崎等用电子显微镜和放射自显影技术,观察到DNA复制过程中存在的不连续复制现象,提出了不连续复制模式,即以5′→3′方向模板链合成的互补链也是沿5′→3′方向延伸,但与复制叉的前进方向相反,合成许多短的片段,这些片段称为冈崎片段(Okazaki fragment);DNA连接酶再将冈崎片段连接成完整的DNA链,称为随从链(lagging strand)。由于前导链的合成是连续进行的,而随从链的合成是不连续进行的,所以DNA的复制是半不连续复制(semi-discontinuous replication)。随从链的合成要等待模板解开足够长度才能开始,因此比前导链迟一些,所以两条互补链的合成是不对称进行的。

在电子显微镜下和利用放射自显影可以观察到DNA复制过程中形成的类似于眼睛状的结构,称为复制眼(replication eye)(图3-6)。复制眼的两端即复制叉。复制眼可以有一个复制叉,即单向复制(uni-directional replication),也可以有两个复制叉,即双向复制(bi-directional replication)。

(四)复制的基本过程

DNA复制大致分为3个阶段,即复制的起始、DNA链的延长和复制的终止。DNA复制过程十分复杂,但基本上都包括:①DNA双链解开;②RNA引物的合成;③DNA链的延长;④切除引物、填补缺口、连接相邻DNA片段;⑤切除和修复错配碱基。原核生物与真核生物的DNA复制有所不同,将分别进行介绍。

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