新冠抗原荧光测试操作方法

时间：2022-05-13 理论教育版权反馈

【摘要】：荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性相结合的一种免疫分析技术，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。荧光免疫技术分为免疫荧光显微技术和荧光免疫测定两大类。荧光免疫测定主要用于体液标本中微量抗原或抗体的定量检测。荧光抗体是将荧光素或镧系螯合物等荧光物质与特异性抗体以化学共价键的方式结合形成的。荧光免疫技术一般应用光致荧光物质进行标记。

单元二　荧光免疫技术

单元学习目标

1.掌握荧光免疫技术的基本原理及类型。

2.熟悉常用的荧光物质和荧光抗体的制备。

3.了解荧光免疫显微技术的操作，明确操作注意事项。

荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性相结合的一种免疫分析技术，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。1941年Coons等首次采用异硫氰酸荧光素标记抗体，检测小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。近年来，随着一系列新仪器和新方法的问世，荧光免疫技术有了很大的改进和发展，其标准化、定量化和自动化进入了一个新的发展阶段，已成为检验医学、科学研究中很有实用价值的测定方法之一。

荧光免疫技术分为免疫荧光显微技术和荧光免疫测定两大类。免疫荧光显微技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果或是应用流式细胞仪进行自动分析检测。荧光免疫测定主要用于体液标本中微量抗原或抗体的定量检测。

一、荧光素标记物的制备

荧光抗体的制备是荧光免疫技术的关键步骤。荧光抗体是将荧光素或镧系螯合物等荧光物质与特异性抗体以化学共价键的方式结合形成的。

（一）荧光和荧光素

1.荧光

（1）荧光的产生：一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再恢复至基态时，部分能量以电磁辐射的形式发射即发光。荧光发射的特点是可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光，而一旦停止供能，发光（荧光）现象随即停止。可引发荧光的能量种类很多，当激发的能量为光能时称为光致荧光，当激发的能量为化学能时称为化学荧光。荧光免疫技术一般应用光致荧光物质进行标记。

（2）荧光效率：荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率。荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，而是或多或少地以其他形式释放。发射荧光的光量子数称之为荧光强度，它受激发光强度和激发光的波长影响。各个荧光分子都有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长最接近于荧光分子的最大吸收峰波长且测定光波最接近于最大发射光波峰时，可得到最强的荧光效率。

（3）荧光寿命：荧光寿命是指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所需的时间。

（4）荧光的淬灭：荧光的淬灭是指荧光分子的辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。这是由于激发态分子的电子不能恢复到基态，所吸收的能量无法以荧光形式发射所致。

（5）影响荧光强度的因素：①pH值：每一种荧光素都有自己合适的pH值，它保持荧光素分子与溶剂之间的电离平衡。pH值的改变可以引起荧光素荧光光谱的改变，并可造成荧光强度的降低。②温度：一般情况下，温度在20℃时，荧光素开始表现温度淬灭作用，以后随温度升高而加强，可至荧光完全淬灭。温度在20℃以下，荧光素的荧光强度随温度的变化改变不明显，基本上保持恒量。③荧光素的浓度：在一定范围内，荧光强度随荧光素浓度增加而增加。当浓度增加超过该范围时，荧光强度反而开始下降。④其他：荧光强度还受试剂中的杂质、细胞固定剂的影响。例如，苯胺、酚、硝基苯及一些卤化物等都有较强的荧光淬灭作用，戊二醛、甲醛等固定剂可使细胞荧光强度减弱50%。

2.荧光物质　荧光物质是指可产生荧光现象的所有物质，常见的有荧光素、镧系螯合物等。

（1）荧光素：荧光素是指能产生明显荧光的有机化合物。常用荧光物质如下：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、四乙基罗丹明（rhodamine，RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanae，TRITC）、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、藻红蛋白－德州红（energy coupled dye，ECD）、藻红蛋白－花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PeCy5）、藻红蛋白－花青苷7（phycoerythrin cyanin 7，PeCy7）、别藻青蛋白（allophycocyanin，APC）、碘化丙啶（PI）等，它们的荧光特点见表9－3。

表9－3　常用荧光物质的荧光特点

（2）其他荧光物质：

①镧系螯合物：某些三价镧系稀土元素如铕（Eu^3＋）、钐（Sm^3＋）等的螯合物可以发射特征性的荧光，其中以Eu^3＋应用最广。Eu^3＋螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，适用于时间分辨荧光免疫测定。

②酶作用后产生荧光的物质：某些化合物本身并不具备荧光效应，但经酶作用后便可形成具有强荧光的物质。例如，4－甲基伞酮－β^－D半乳糖苷（MUG），经β^－半乳糖苷酶（β^－G）的作用分解成4－甲基伞酮（MU），后者可发出荧光。其他如碱性磷酸酶（AP）的底物——4－甲基伞酮磷酸盐（MUP）和辣根过氧化物酶（HRP）的底物——对羟基苯乙酸（HPA）也都具有荧光底物的性质，可以用于酶免疫荧光分析（表9－4）。

表9－4　酶免疫荧光分析中常用的酶和荧光底物

（二）荧光抗体的制备

1.荧光物质标记抗体的制备　用于荧光物质标记的抗体应具有高特异性、高亲和力和高纯度。作为标记的荧光物质应符合以下条件：①易和蛋白质结合且不易解离；②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后，不影响自身和蛋白质原有的生化和免疫性质。⑤结合物稳定、安全无毒、易于保存。

1）方法　常用的标记方法有搅拌法和透析法两种，以FITC标记为例介绍如下。

（1）搅拌标记法：先将40mg/mL待标记的蛋白质溶液5mL置于量瓶中，用pH值为9.0、0.5mol/L的碳酸盐缓冲液4mL平衡，然后在磁力搅拌下逐滴加入1mL含2mg FITC溶液，在25℃下放置1h，4℃持续搅拌4～6h后，4000rpm，离心15min，上清液即为标记物。此法常适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。该法的影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。

（2）透析标记法：仍以FITC标记为例，先将待标记的10mg/mL免疫球蛋白溶液10 mL装入透析袋中，置于含0.1mg/mL FITC的pH值为9.4、0.01mol/L碳酸盐缓冲液100mL中，磁力搅拌24h，以后再加pH值为7.4、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）透析去除游离荧光素。低速离心（4000rpm，20min），取上清液即为标记物。此法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。该法标记均匀，非特异性荧光染色也较弱。

2）鉴定　抗体标记完成后，应对标记抗体进一步纯化。采用透析法和凝胶柱层析法去除游离的荧光素及其降解产物；采用DEAE－纤维素或DEAE－Sephadex A－50离子交换层析法去除未标记及过度标记的抗体；采用组织制剂（正常大白鼠或小白鼠的肝粉）吸收法和固相抗原吸收法去除杂抗体或交叉反应抗体。荧光素标记的抗体，在使用前还应对其抗体效价（抗体活性）和荧光素与蛋白质结合比率等加以鉴定。为防止抗体失活和荧光淬灭最好小量分装，加入0.02%NaN₃或0.01%硫柳汞防腐，避免反复冻融，－20℃冻存后可保存1～2年，真空干燥后可长期保存。

2.镧系元素标记物的制备　镧系稀土元素离子不能直接与蛋白质结合，因此需要利用具有双功能基团的螯合剂将稀土元素与抗体或抗原分子的氨基偶联，形成镧系元素离子－螯合剂－抗原（或抗体）复合物，以获得稳定的稀土元素标记物。螯合剂可先螯合Eu^3＋，再连接蛋白质（一步法）；或先连接蛋白质，再螯合Eu^3＋（二步法）。常用的螯合剂如：多羧基酸类螯合剂如异硫氰酸－苯基－EDTA，β^－二酮体类螯合剂如2－萘酰三氟丙酮（2－NTA）等。

二、荧光免疫显微技术

（一）基本原理

荧光免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术。

（二）技术类型

根据标记物和反应程序的不同，可将荧光免疫显微技术分为直接法和间接法两类。

1.直接法　将适当稀释的荧光物质标记的特异性抗体直接滴加于已固定的待测标本上，置带盖的湿盒内，25～37℃温育30min，充分洗涤干燥。不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原（彩图15）。此法常用于细菌和病毒等病原微生物的快速检测、肾活检及皮肤活检的免疫病理检查。

2.间接法　间接法中荧光素标记的是抗球蛋白抗体即抗抗体（第二抗体）。技术要点如下：用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原片上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原与抗体充分结合，洗涤除去未结合的抗体，再加上荧光标记的抗球蛋白抗体，从而检测未知抗体（彩图16）。此法常用于检测各种自身抗体。

3.双标记法　反应原理同直接法。用两种荧光素（FITC和RB200）分别标记两种不同的特异性抗体，对同一标本进行荧光染色，在荧光显微镜下用两种不同的激发光激发。若有相应的两种抗原同时存在，可显示两种颜色的荧光（黄绿色和橘红色）。本法主要用于同时检测细胞表面两种抗原的分布与消长关系，区分末梢血或同一切片中T细胞和B细胞等。

（三）技术流程

1.标本的制作　荧光免疫显微技术依靠观察标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位，因此标本制作的好坏直接影响到检测结果。在制备标本过程中，应力求保持抗原的完整性，并在染色和洗涤等过程中不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄，以利抗原与抗体接触和镜检。标本中干扰抗原－抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。

常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。不同标本可制作涂片、印片或切片，如组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片对于组织细胞的精细结构显现清楚，可用于回顾性研究，但对抗原的保存量不如冷冻切片，操作烦琐，结果不稳定，非特异性荧光反应强。冷冻切片可使抗原大量的保存，操作简便，自发荧光较少，缺点是组织结构欠清晰。组织材料也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。

除活细胞外，其他标本片应在染色前以适当方式固定。丙酮和乙醇是常用的固定剂，其中，尤以冷丙酮对冷冻切片的固定效果好，而乙醇加95%冰醋酸对于涂片抗原的固定效果较理想，固定时间一般为5～15min。对制备好的标本应尽快染色检查，或置－20℃下低温保存。

2.荧光抗体染色　可用直接法或间接法进行染色。

3.荧光显微镜检查　荧光显微镜观察时，应在通风良好的暗室内进行，且在染色后即做镜检，以防荧光消退，影响结果。荧光显微镜与普通显微镜的主要不同之处在于光源、滤光片、聚光器及镜头等。荧光显微镜通常用高压汞灯、氙灯或卤素灯作为激发光源。正确选择滤光片能获得良好荧光观察效果。滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片三种。隔热滤光片位于灯室的聚光镜前面，能阻断红外线的通过而隔热；激发滤光片位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，以提供合适的激发光；吸收滤光片位于物镜和目镜之间，能阻断激发光而使发射的荧光透过，使标本在暗的背景上呈现荧光易于观察，也使眼睛免遭强激发光刺激。例如，观察FITC标记物时可选用激发滤光片BG12（蓝紫色）配以吸收滤光片OG4（橙黄色）或GG9（淡绿黄色）。聚光器有明视野、暗视野和相差荧光器等，它与光源、光路、激发滤光片适宜组合，以期在黑色的背景上获得满意的荧光。荧光显微镜上有消色差、氟及复消色差三种目镜镜头，常用的是消色差镜头。荧光显微镜的光路分为透射光和落射光两种形式。透射光的照明光线是从标本下方经过聚光器会聚后透过标本进入物镜，适于观察对光可透的标本。落射光的照明光线从标本上方经特殊的分光镜反射从物镜周围落射到标本上，荧光经标本反射而进入物镜，适于观察透明度不好的标本以及各种活性组织等（图9－5）。

4.荧光强度判定　荧光强度的判断一般用“＋”号表示。“－”为无或仅见极微弱荧光；“＋”为荧光较弱但清楚可见；“＋＋”为荧光明亮；“＋＋＋”为耀眼的强荧光。临床上根据荧光强度将特异性荧光强度达“＋＋”以上判定为阳性，而对照光应呈“－”或“±”。

图9－5　荧光显微镜成像示意图

5.荧光对照　荧光对照是指每次实验时应设立严格的实验对照（阳性和阴性对照），正确区分特异性荧光染色和非特异性荧光染色，以排除假阳性和假阴性结果的干扰。在荧光显微镜检查中，非特异性荧光染色是直接影响检测结果的主要问题，其原因可能是某些抗原的自发荧光、交叉反应及染色时间过长，干燥、固定、洗涤不当所致，可以通过对照进行鉴别与排除。荧光抗体染色的对照包括阳性和阴性对照。阳性对照即为已知的标记抗原抗体复合物，阴性对照则包括：①用与特异性抗体种属相同的动物血清或同一动物免疫前的血清标记荧光素代替特异性抗体，结果应为阴性；②染色抑制试验：将未标记荧光素的已知抗体先与切片的靶抗原反应，然后再加荧光素标记的相同抗体，结果应为弱阳性或阴性；③用PBS代替荧光抗体，结果应为阴性；④标本自发荧光对照，即切片标本经PBS洗后不加荧光抗体，应为阴性。

（四）方法评价

荧光免疫显微技术可用于组织学中抗原或抗体的定位、定性检查，既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强。其缺点是荧光容易消退，难以制备永久性标本，非特异荧光的干扰常影响结果的判断。

直接荧光免疫法操作简便、特异性高、非特异性荧光干扰因素少，缺点是敏感性偏低，而且每检查一种抗原需制备相应的特异性荧光抗体。间接荧光免疫法的敏感性高于直接法，而且制备一种荧光抗体可用于检测多种抗原或抗体，缺点是参与的因素多，易出现非特异性荧光，操作时间较长。

（五）临床应用

荧光免疫显微技术在临床检验中已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。

1.血清中自身抗体的检测　荧光免疫显微技术是检测各种自身抗体的良好工具，在自身免疫病的实验诊断中应用日益广泛。其突出的优点是能够用简单的方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分，并且能够在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。主要用于检查抗核抗体、抗线粒体抗体、抗平滑肌抗体、抗dsDNA抗体、抗甲状腺球蛋白抗体、抗骨骼肌抗体及抗肾上腺抗体等。

2.各种微生物的快速检查和鉴定　因荧光免疫显微技术具有快速、简便、敏感性高的优点，可作为细菌的辅助鉴定手段，如脑膜炎奈瑟菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、布鲁菌和炭疽芽胞杆菌的鉴定。但因荧光淬灭和非特异荧光干扰等因素，不能代替常规诊断。荧光抗体染色法检测血清中的抗体可用于流行病学调查和临床回顾诊断。用荧光抗体染色法检测梅毒螺旋体抗体是梅毒特异性诊断的常用方法之一。荧光免疫技术在病毒学检验中具有重要意义，因为普通光学显微镜看不到病毒，用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况。

3.寄生虫感染的诊断　间接荧光免疫显微法是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法，对肠外阿米巴，尤其是阿米巴肝脓肿也有很高的诊断价值。

4.白细胞分化抗原的检测　用白细胞分化抗原（CD分子）相应的荧光单克隆抗体可对血液中B细胞和T细胞等进行鉴定和分群。

此外，还应用于人类白细胞抗原（HLA）、肿瘤组织中肿瘤抗原、组织中免疫球蛋白和补体组分、激素和酶的组织定位等的检测。

三、荧光免疫测定技术

荧光免疫测定技术是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，定量测定液体标本中的微量物质。常用的荧光免疫测定技术主要有时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定等技术。

（一）时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay，TR－FIA）

1.基本原理　时间分辨荧光免疫测定是以镧系元素螯合物标记抗原或抗体而建立的一种新型非放射性微量分析技术。

镧系元素螯合物具有较长荧光寿命，利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。此外，这种方法的激发光与荧光的波长差别显著，其波长转变达270nm，可有效排除激发光的干扰，测得的荧光为稀土元素螯合物发出的特异性荧光信号（彩图17）。

2.技术类型

（1）双抗体夹心法　待测抗原与固相抗体反应，洗涤后再加入Eu^3＋标记的抗体，形成固相抗体－待测抗原－Eu^3＋标记抗体复合物，在酸性增强液作用下，复合物中的Eu^3＋从免疫复合物中解离形成新的微粒，在340nm激发光照射下，游离出的Eu^3＋螯合物可发射613 nm的荧光。经时间分辨荧光分析仪记录并计算待测抗原含量（彩图18）。荧光强度与待测抗原浓度成正比。

（2）固相抗原竞争法　将大分子抗原直接包被或小分子半抗原通过化学偶联法制成半抗原－蛋白质结合物包被在固相上，成为固相抗原。待测抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu^3＋标记抗体，标本中待测抗原浓度越高，则Eu^3＋标记抗体结合到固相上的量越少，因此所测得的荧光强度与标本中待测抗原浓度成反比。

（3）固相抗体竞争法　待测标本中抗原和Eu^3＋标记的抗原与固相抗体（特异性抗体包被固相）发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所测得的荧光强度与待测抗原含量成反比。目前为了生产试剂盒的方便，常用抗抗体（Ab₂）包被固相，这种固相抗抗体实际上是一种通用的分离剂，分离Eu^3＋标记抗原和Eu^3＋标记抗原抗体复合物。

3.技术要点　以双抗体夹心法检测甲胎蛋白（AFP）为例。以抗人AFP多克隆抗体包被聚苯乙烯微量滴定条或珠，加入不同浓度的AFP标准品和待测血清，加入缓冲液反应4～6h。洗涤后，加入生物素化抗人AFP单克隆抗体，振荡温育反应4～6h。洗涤后，加入Eu^3＋标记的链霉亲和素，振荡反应1h。洗涤后，加入增强液，快速振荡15min，放置15 min后在时间分辨荧光分析仪上测量，从编制程序直接得出待测血清中AFP浓度。

4.方法评价　TR－FIA方法特异性强，灵敏度高（可达0.2～1ng/mL），标准曲线范围宽（跨越4～5个数量级），分析速度快，标记物制备较简便、有效使用期长，无放射性污染，因此是很有发展前途的超微量物质免疫分析技术。

5.临床应用　时间分辨荧光免疫测定应用范围十分广泛，用RIA或ELISA测定的物质均可以用该法测定，如测定各种激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、蛋白质、酶、药物、肿瘤标记物和病毒抗原等。

（二）荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）

1.基本原理　FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法。其原理是：待测的小分子抗原和荧光素标记的小分子抗原（恒定量）与相应抗体（恒定量）竞争结合。当待测的小分子抗原浓度高时，经过竞争反应，大部分抗体被其结合。而荧光素标记的小分子抗原多呈游离状态，因其分子小，在液相中转动速度较快，测量到的荧光偏振强度也较低。反之，如待测的小分子抗原浓度低时，大部分荧光素标记的小分子抗原与抗体结合，形成大分子的标记抗原抗体复合物，此时检测到的荧光偏振强度也较高，即荧光偏振强度与待测小分子抗原浓度成反比（彩图19）。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。

2.技术要点　以环孢素测定为例。

（1）标本的预处理　取待检全血，加入溶解剂和蛋白沉淀剂，混匀后离心，上清液待用。

（2）抗原抗体反应　在反应管中分别加入一定量的预处理标本上清、荧光素标记的环孢素、抗环孢素单克隆抗体及反应缓冲液进行抗原抗体反应。

（3）偏振荧光强度测定　抗原抗体反应开始时，立即用荧光偏振免疫分析仪测定其空白偏振荧光强度（P₁），反应结束时再测定其偏振荧光强度（P₂），根据待测标本的偏振荧光强度P（P₂－P₁），从标准曲线上直接计算出所测物质的含量。

3.方法评价　FPIA方法具有下述优点：①均相测定方法简便，易于快速、自动化进行；②荧光标记试剂稳定、有效期长，结果可靠；③可用空白校正除去标本内源性荧光干扰，获得准确结果。其缺点是通常不适用于大分子物质的测定。与非均相荧光免疫分析方法相比，灵敏度稍低一些，为提高FPIA灵敏度，可将相对大量的标本进行预处理以去除干扰成分。如测定血清地高辛之前，血清蛋白先进行沉淀处理可使检测限达到0.2ng/mL。

4.临床应用　荧光偏振免疫测定特别适用于测定血清或尿液中小分子抗原物质，目前已有几十种治疗药物和成瘾药物包括激素、维生素及常规生化项目用荧光偏振免疫测定进行分析和定量测定，如环孢素、卡马西平、苯妥英钠、丙戊酸、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥、鸦片浓度等的测定。

（三）荧光酶免疫测定

荧光酶免疫测定是利用酶标记抗原（或抗体），与待检抗原（或抗体）反应，借助酶反应底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度计算出待检抗原或抗体的含量。其常用的酶是碱性磷酸酶，荧光底物是4－甲基伞形酮磷酸盐。该技术由于使用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，故具有较高灵敏度。荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、过敏原等。

目前，时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定都有全自动的检测分析仪器，这些仪器具有试剂和样本条码识别系统，能自动加样、温育、洗涤、分离、测定荧光强度、处理数据和报告结果。

四、荧光免疫显微技术检测案例

【要求】

（1）学会正确使用荧光显微镜。

（2）学会间接荧光免疫法的操作和结果分析。

【用途】

检测巨细胞病毒pp65抗原，作为HCMV活动性感染的诊断指标。

【内容】

间接免疫荧光法测定CMV pp65抗原。

【相关知识点】

（1）原理：利用免疫荧光法检测pp65抗原是将患者外周血多形核白细胞制成涂片，用抗CMV pp65单克隆抗体作为一抗，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行检测。

（2）pp65检测意义：目前临床对巨细胞病毒感染的检测除主要检测抗HCMV－IgM类抗体外，也可检测CMV pp65抗原。pp65是CMV复制早期产生的被膜蛋白，位于CMV衣壳与包膜之间。CMV活动性感染时外周血多形核白细胞中CMV复制活跃，表达pp65抗原。

【准备】

抽取静脉血3mL，用肝素抗凝，并保存在2～8℃送检。

【操作步骤】

参照试剂盒说明书进行操作，主要步骤如下。

（1）外周血多形核白细胞的分离：利用右旋糖酐法或自然沉降法分离抗凝血中白细胞。

（2）涂片制备：用分离的多形核白细胞涂片，每片2×10⁵个细胞，干后用4%的中性多聚甲醛固定。

（3）用抗CMV pp65单克隆抗体滴加于细胞片上，37℃湿盒反应1h，洗片，晾干。

（4）在细胞涂片上滴加工作浓度的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃湿盒避光反应1h，洗片，晾干，置于荧光显微镜下观察。

【注意事项】

每批试验均应设阳性与阴性对照，同法进行测定。

【结果判断】

镜下多形核白细胞胞质中出现黄绿色荧光者为pp65阳性细胞。全片≥5个pp65阳性细胞，判断为阳性。

【结果分析及临床意义】

（1）结果分析：正常人外周血多形核白细胞CMV pp65抗原呈阴性。阳性结果表明受检者体内有巨细胞病毒的活动性感染。

（2）临床意义：利用间接免疫荧光法检测CMV pp65抗原较ELISA法检测抗HCMVIgM抗体敏感性更高，且能早期、快速地诊断出HCMV的活动性感染。据文献报道该法已作为监测HCMV在疾病中活动性感染的标准方法之一，为临床提供诊治依据。

（阳大庆）

重点提示

1.荧光免疫显微技术的要点　荧光免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术，也属于一种免疫组化技术。标本的制作和荧光染色是其关键要点，此外还应注意通过对照的设立来减弱或消除非特异性荧光的干扰。

2.荧光免疫测定的技术类型及其区别　荧光免疫测定可分为均相和非均相两种类型。均相荧光免疫测定包括荧光偏振免疫测定和底物标记荧光免疫测定，而非均相荧光免疫测定则包括时间分辨荧光免疫测定和荧光酶免疫测定。它们之间的主要区别在于：均相荧光免疫测定不需要在抗原抗体反应后分离结合的与游离的荧光标记物，且其中的标记物失去了荧光特性，而非均相荧光免疫测定需要在抗原抗体反应后分离结合的与游离的荧光标记物，且其中的标记物未失去荧光特性。

3.时间分辨荧光免疫测定的特点　时间分辨荧光免疫测定是用镧系稀土元素（如Eu^3＋等）的螯合物标记抗体或抗原，检测标本中的相应抗原或抗体。该法可以延缓测量时间，排除标本中非特异性荧光的干扰，而且这种方法激发光与荧光的波长差别显著，其波长转变达270nm，可有效排除激发光的干扰。

4.几种常用荧光免疫技术的比较

几种常用荧光免疫技术的比较见表9－5。

表9－5　常用荧光免疫技术的比较