肿瘤中的表观遗传变异

肿瘤是一个渐进的过程，它通过细胞机制选择上的失调给予其克隆上的优势，从而导致肿瘤生长，并且最终转移。事实上，几乎所有的肿瘤都是由几种“标志性”的能力所定义的，这些能力包括抗细胞死亡、逃避生长抑制、增殖失控、新生血管形成、侵袭／转移和复制不朽等能力。其他的异常控制过程，例如缺陷性分化和DNA损伤修复，也与肿瘤的形成相关联。由于最初技术的限制及对于其他遗传模式中基因调控有限的理解，传统的研究工作侧重于对引起恶变的基因异常进行研究。对于这些基因改变（拷贝数变异、基因突变、基因重排）的早期研究已经定义了肿瘤的发生机制，并孕育了靶向性治疗的产生，改善了某些肿瘤的治疗效果。而在表观遗传方面，由于发展较晚，直到最近才证明，通过药物调控肿瘤表观遗传谱也可获得很好的治疗效果。如今，诸如5－氮杂胞苷（5－azacytidine）和地西他滨（decitabine）的临床治疗应用，已经证明了在肿瘤中靶向性的表观遗传改变可以对治疗产生明确的益处。因此，理解遗传改变如何影响肿瘤表观遗传组，将会为开发更好的治疗策略提供新的可能性。

一直以来，人们认为肿瘤发生的过程伴随有大量遗传及表观遗传变异。研究发现，肿瘤表观遗传学的改变与肿瘤从发生到发展转移过程中的各个方面都息息相关。DNA的甲基化和去甲基化，还有染色质组织的改变都会对肿瘤相关的表型产生影响。近年来，新的测序技术的应用在肿瘤中发现了大量表观遗传调控因子的突变，其中有很多可能是驱动性突变（driver mutation），从而为肿瘤表观基因组与基因组的改变提供了关联机制（图15－3）。事实上，现在的肿瘤基因组分析的主要目标是从大量肿瘤基因组突变中真正地识别驱动性突变。这些突变是由它们促进或“驱动”肿瘤形成的能力来定义的，并因此在肿瘤的发展过程中被选择。相比之下，伴随性突变（包括了大多数被检测到的突变）则代表了对细胞生长优势没有直接或间接影响的基因事件。多种表观遗传学驱动基因已经被发现，或者其为横跨多个肿瘤的突变（例如，KDM6A在超过12种肿瘤中突变），或者是极易复发的基因突变（如IDH1R132），或者是在选择肿瘤组织学类型时有高相关性的突变（如MLL2在滤泡性淋巴瘤中）。这些驱动基因突变的特性增强了我们对于其有利于肿瘤发生机制的理解，改善了预后评估，并且开启了令人兴奋的新疗法的研发。在本节中，将介绍表观遗传调控元件在肿瘤中基因突变的最新进展、新的发现及治疗进展。

图1 5－3人类癌症中经常突变的表观遗传调控子

图示为癌症表观基因组突变中具有代表性的原癌基因和抑癌基因及在肿瘤组织中的突变频率。

＊表示该基因在肿瘤发生中的作用（原癌或抑癌）具有混合性或仍有待确定。

一、DNA甲基化和羟甲基化

DNA甲基化在发育和疾病（包括肿瘤）方面扮演着重要角色。最早在1975年发现，CpG岛甲基化作为DNA上相对稳定的修饰能够沉默基因转录。现在了解到DNA甲基化要比想象中动态和复杂得多，基因组不同位点的甲基化会带来不同的表观遗传结果。例如，基因启动子区域CGI的甲基化能有效抑制转录起始，然而在CpG缺乏的基因体里的甲基化可以帮助延伸及影响可变剪接模式。DNA甲基化还经常在基因组的重复富集区域发现，如反转录病毒的转座子区域，并且对染色体和基因组的稳定性至关重要。然而，该表观遗传修饰在基因组的其他调控区域，如增强子、绝缘子及转录区等处的作用至今尚不明确。DNA甲基化异常是人肿瘤基因组的一个明确特征，全局启动子CGI高甲基化及非CGI区域低甲基化已被广泛报道。在几个关键位点甲基化的局部改变已被证明足以引起肿瘤。重要的是，这些被改变的DNA表观遗传标志模式（如5－m C，5－hm C）经常伴随着参与分化和干性维持的转录组的严重不平衡，因此起始了肿瘤发生并维持生长。

在分子机制上，DNA甲基化能够和基因突变一起导致抑癌基因的失活。例如，在遗传性胃癌中，编码E－钙黏着蛋白肿瘤抑制子（cadherin 1，CDH1）的甲基化能够在第1个等位基因突变的情况下作为“第2次打击”引起胃癌。在散发性肿瘤中，肿瘤抑制基因的遗传突变经常被DNA甲基化沉默取代。例如，在遗传性非息肉性结肠癌（hereditary non－polyposis colorectal cancer，HNPCC）中，MLH1突变失活能够引起微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）及肿瘤发生，然而在散发性结肠癌中，MLH1经常被甲基化沉默。这些数据显示，DNA甲基化异常能够改变肿瘤相关基因的表达水平并促进肿瘤发生。

（一）DNMT3A

DNA甲基化由哺乳动物的DNMT完成，它是催化CpG位点胞嘧啶甲基化的必需酶。5－胞嘧啶（5－cytosine，5－C）到5－m C的转变需要甲基供体S－腺苷甲硫氨酸（S－adenosyl methionine，SAM）及具有催化活性的DNMT酶（DNMT1、DNMT3A或DNMT3B）的参与。DNMT3A是一个相对分子质量102 000的蛋白，具有高度保守的功能结构域：1个N端的PWWP结构域、1个半胱氨酸富集的PHD锌指结构域及1个C端的催化结构域。在细胞内，DNMT3A及其同源物DNMT3B形成复合体，并主要负责DNA从头（de novo）甲基化，特别是在早期发育过程中的印迹基因甲基化的建立。DNMT酶长久以来一直被怀疑在肿瘤发生中扮演角色。例如，DNMT3A和DNMT3B被发现在造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）自我更新和分化（2个被紧密调控的过程，如被扰动会引发肿瘤）中发挥作用。

DNMT3A突变在多种急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）中被发现，发生率高达22.1％。大部分突变发生在酶活催化区的R882位点（60％～64％），而且几乎都是杂合性。DNMT3A突变聚集在具有中度风险的细胞遗传背景和正常核型的AML患者中。它们也与年龄增长、M4和M5AML亚型、更糟糕的整体生存期（overall survival， OS）、无复发生存期（recurrence－free survival，RFS）及诊断爆炸性增加相关联。由于表观遗传调控改变经常会导致基因组不稳定，DNMT3A突变可能会进一步推动疾病本身的发展。最近的研究证明DNMT3AR882的突变可能是AML的发起性变异。

DNMT3A突变发生在其他的髓性恶性肿瘤中也被报道，尽管频率较低。例如，骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS；3％～8％）、骨髓增生性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN；2％～10％）及早期T细胞前体急性淋巴细胞白血病（ETP－acute lymphoblastic leukaemia，ETP－ALL，16％～18％）。R882也是在这些肿瘤中最频繁的突变位点（60％）。在临床上，DNMT3A突变也与年龄增加及各种类型的预后相关联，包括更差的OS、无事件生存期（event－free survival，EFS）和无AML生存率。

DNMT3AR882突变是功能缺失还是功能获得性突变，目前仍在争论中。一项研究表明，DNMT3A是一个原癌基因，因为它在一些肿瘤中过表达，敲除该基因后导致增殖和转移降低。5－aza－d C通过抑制DNA甲基化而间接抑制DNMT3A，可导致细胞凋亡。一些研究则证明突变的DNMT3A（R882H）催化能力明显下降（约50％），DNA的体外结合能力也有所下降，暗示它可能通过显性失活机制表现功能缺失表型。要理解这些肿瘤相关突变作用的具体机制还需要进一步的研究。

（二）TET2

TET家族蛋白最早是在具有t（10；11）（q22；q23）转位染色体的AML患者中发现的，而这种转位染色体会产生MLL－TET1融合蛋白。2009年，研究表明TET蛋白具有催化DNA中CpG位点5－m C转化成5－hm C的双加氧酶的活性，其催化活性依靠2－酮戊二酸、氧、Fe2＋和抗坏血酸做为辅基。后续研究发现，TET酶可能通过被动或主动途径负责DNA去甲基化。例如，以5－hm C标志的CpG双核苷酸不能被DNMT1识别，因此通过细胞分裂，这些位点的甲基化被动缺失。最近通过体外实验发现，TET酶在主动去甲基化中扮演着更加重要的角色，TET酶能够将5－m C转化成5－hm C，将5－hm C转化成5－f C，最后将5－f C转化成5－ca C。5－ca C作为碱基切除修复酶的靶点完成去甲基化过程。然而，MLL－TET融合蛋白如何导致AML的机制现在还不清楚。

相对于TET1，TET2在多种肿瘤中，如AML、MDS及MPN中，有更高频率的突变。在这些髓性肿瘤中，大部分TET2突变（55％）都是杂合性的。TET2的复发突变（在同一位点的高频率突变）很少被报道，许多突变造成移码或停止密码子过早从而导致TET2失活。在髓性肿瘤中TET2突变与全局5－hm C水平降低显著相关，而且TET2缺失能够重塑髓性肿瘤的表型，这表明TET2缺失可能是白血病形成的关键性事件。尽管TET2突变与已知的髓性白血病驱动基因（FLT3－ITD，RUNX1，CEBPA）几乎没有关联，但它与NPM1和ASXL1突变有关，并且与IDH1或IDH2突变经常共同发生。而且TET2突变更经常地发生在正常核型和中度危险的AML中。不像DNMT3A突变，TET2突变在白血病预后方面具有局限性。目前发表的大量研究发现，带有TET2突变的患者和不带TET2突变患者的OS或其他预后指标没有显著变化。

TET2突变对DNA甲基化状态的影响现在还不很确定。除了TET2失活突变后预计的5－m C水平上升，一些研究也报道了全局甲基化的降低。然而，对特定基因启动子的分析显示出在TET2突变样本中的结果不一致性，经常表现出启动子特异的过甲基化而不是全局水平的低甲基化。这表明TET2、DNA甲基化状态和恶性转化之间的关系还不明确。总的来说，大量证据表明肿瘤中TET2失活可能不仅仅影响了DNA甲基化，还可能更多的是由于TET2与其他表观遗传调控子及发育相关的转录因子的相互作用扰乱导致的。

（三）IDH1／2

异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）和异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）是两种同源的代谢酶，该酶将异柠檬酸转化成α－酮戊二酸（α－ketoglutarate，α－KG），而将NADP＋还原成NADPH。IDH1存在于胞质溶胶和过氧化物酶体中，而IDH2只存在于线粒体中。在对22名患者的肿瘤样本的全外显子组测序中，IDH1复发突变最初发现于胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM；12％），更进一步的测序工作揭示突变最普遍发生在WHO分级Ⅱ／Ⅲ胶质瘤（71％）和继发性GBM（88％），但在初发性GBM中不太常见（7％）。随后的研究表明IDH2突变也在WHO等级Ⅱ／Ⅲ神经胶质瘤中富集，尽管不那么频繁，但IDH1／2突变发生相互排斥，说明它们导致肿瘤的机制很可能是一致的。最近的数据还表明，IDH1和IDH2突变分别与星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤关联。IDH突变与MGMT启动子过甲基化、TP53突变、1p／19q共缺失、ATRX失活、低龄化及与较好的预后呈正相关，而与脑胶质瘤中的EGFR扩增呈负相关。在神经胶质瘤中被发现后，IDH的高频突变在AML中也被发现（23％）。此外，IDH复发性突变还出现在软骨肉瘤（56％）、胆管癌（23％）、黑素瘤（10％）和前列腺癌（2％）中。

到目前为止，所有在肿瘤中发现的IDH突变型都是杂合型且高度重复出现。IDH1－R132、IDH2－R172和IDH2－R140Q残基的替换突变最为常见，R132（R／H，R／C，R／S，R／G，R／L，R／V）和R172（R／G，R／M，R／K）在其中占有相当大的比例。这些位点的突变位于IDH1和IDH2的活性部位，并改变了IDH的酶活。突变体的IDH可以催化产生大量的2－羟基戊二型产物（2－hydroxyglutarate，2－HG），使得病变组织中2－HG浓度高于正常组织上百倍。而2－HG的分子结构与常见代谢物2－酮戊二酸（2－oxoglutaric acid，2－OG）十分相似。所以异常高浓度的2－HG会和2－OG竞争结合那些以2－OG为辅基的催化酶，其中就包括上文提到的TET家族蛋白和JMJC家族的去甲基化酶，还有一些羟氧化酶。因此，突变体IDH的影响是多效性的，它影响许多细胞过程，包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、HIF1A稳定性、胶原蛋白合成及代谢。例如，在黑素瘤中IDH突变和TET2突变相似，可以影响全局水平上的5－hm C，并且5－hm C模式的重建在黑素瘤细胞和斑马鱼的模型都可以抑制肿瘤侵袭和生长。IDH突变还会通过抑制羟氧化酶PHD，使得HIF1A稳定化，或是促使羟化胶原水平降低，导致EMC结构改变，以及调节NADP／NADPH的比例以改变代谢水平。

令人欣慰的是，针对IDH突变的小分子药物已经问世，其不仅在动物模型中被证实有促白血病分化的效果，而且在临床实验中表现良好。

二、组蛋白甲基化

近年来，发现了很多与组蛋白甲基化和去甲基化修饰相关的酶，包括甲基化转移酶EZH2、SETD2、MLL、NSD1／2，去甲基化转移酶KDM6A和KDM1A等，这些酶的突变与肿瘤发生具有很大的关联性。

（一）EZH2

EZH2／KMT6是多梭子（polycomb）抑制复合物2（polycomb repressive complex 2， PRC2）的酶活性成分，负责H3K27的甲基化和基因沉默。PRC2复合物的其他成分包括，与EZH2相互作用的组分胚胎外胚层发育（embryonic ectoderm development，EED）、SUZ12 （suppressor of zeste 12homologue）和RBAP48／RBBP4。这些polycomb组分（Pc G）蛋白在分化、细胞识别、干细胞塑性及增殖过程中发挥重要的调节作用。因此，细胞中PRC2组分中任何一个组分的缺失都将产生重要的生理反应。

EZH2基因的表达失调最早发现在乳腺癌和前列腺癌中，其水平的升高暗示EZH2可能是致癌基因。这一发现在体内和体外均被验证，EZH2的过表达造成癌细胞的增殖及原代成纤维细胞的转化。最近的测序研究显示，各种类型的白血病和淋巴癌，包括滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL；7％～22％）、弥散性巨型B细胞淋巴瘤（diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL；14％～ 21.7％）、高度 B 细胞淋巴瘤（18％）、MDS／ MPN （myelodysplastic／myeloproliferative；6％～13％）、慢性髓细胞单核细胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia，CMML；11.1％）、T－ALL和AML中EZH2有多处突变。有趣的是，其中高频出现了错义突变和截断突变，这种突变能够影响EZH2是否产生致癌功能。

基因组测序鉴定到在FL、DLBCL和其他淋巴样肿瘤中高频出现的杂合Y641突变（Y／F、Y／N、Y／H、Y／C）被认为是一个里程碑的发现。EZH2野生型和Y641突变体在体内和体外有非常显著的协同作用。野生型的EZH2能够高效催化生成H3K27的一甲基化，而不是二甲基化和三甲基化。而EZH2Y641突变体则能够催化H3K27的二甲基化和三甲基化，这些突变的总体结果是协同作用使得病变组织中的H3K27三甲基化大大提高，并导致有关的基因沉默。

特别是近期的研究结果显示，EZH2突变引发的肿瘤可以作为小分子抑制剂的靶标（详见本节“表观遗传药物在肿瘤治疗中的应用”）。

（二）SETD2

在哺乳动物中，H3K36me3主要的甲基化转移酶是SETD2／KMT3A，该蛋白被鉴定为新的肿瘤抑制基因（tumor suppression gene，TSG）。在肾透明细胞癌衍生细胞系中SETD2基因缺失很常见。在乳腺癌中SETD2表达量降低并且伴随有H3K36me3水平的降低。SETD2突变在肾透明细胞癌相当普遍（7.4％～11.6％），以及儿童高程度胶质瘤（high grade glioma，HGG；15％）和成人高程度胶质瘤（8％）。迄今为止的研究发现，SETD2突变主要是移码或无义突变造成截断，进一步表明SETD2在这些肿瘤中是重要的肿瘤抑制基因。另一项研究发现，SETD2突变与肾透明细胞癌较差的癌特异性存活率（cancer specific survival，CSS）显著相关。虽然SETD2失活表型效应尚未明确，最近的研究表明，SETD2损失触发MSI并能通过H3K36甲基化改变增加全基因组突变率。

（三）MLL

哺乳动物混合系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）家族基因编码了一系列有活性的（MLL1－4／KMT2A－D）和无活性的（MLL5／KMT2E）甲基化转移酶，都与肿瘤有关。MLL1－4负责甲基化H3K4，并且与WDR5、Rb BP5、DPY－30和Ash2L形成一个共同的核心。值得注意的是，MLL1－2连同MENIN（MEN1）肿瘤抑制因子形成复合物。最近的证据表明，H3K27去甲基化酶KDM6A／UTX可以与MLL2－4形成复合物。

已知最早的MLL家族基因异位包括MLL1在11q23的频繁重排，重组涉及超过40个不同的相邻基因，发生在60％～80％患有ALL或AML婴儿的基因组上。自那时以来，在膀胱癌、肺癌及乳腺癌的MLL1基因上先后鉴定到几个错义和截断突变。虽然MLL1在液体肿瘤中是一个主要的致癌基因，但是这些新的发现表明MLL1在某些固体肿瘤中也有作用。在髓母细胞瘤和头颈部鳞状细胞癌（头颈部鳞癌）（head and neck squamous cell carcinoma， HNSCC）中MLL4也显示出截断突变。

值得注意的是，近期在MLL2和MLL3基因上鉴定到很多新的突变，显示出突变的多样性和肿瘤类型的多样性。MLL2和MLL3突变主要为无义突变或者移码突变，从而产生一个截短的缺乏SET结构域的蛋白。MLL1／4和MLL2／3突变说明MLL蛋白家族在肿瘤发生中的双重角色，这可能在很大程度上依赖于细胞环境。另外此类突变已发现在多种肿瘤中，偶尔出现高频率，包括结肠癌（MLL3，14％～17％）、DLBCL（MLL2，24％～32％）、FL（MLL2，89％）、AML、乳腺癌、神经母细胞瘤（GBM）、肾透明细胞癌（RCC）、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、髓母细胞瘤及HNSCC。但因缺少功能性数据，目前这些突变的重要性尚未被表征。一项有趣的研究结果显示，在大肠癌，MLL3突变与MSI的升高有关，但是没有具体阐明机制。无论如何，这些突变是进一步研究肿瘤的潜在靶点，特别是MLL蛋白家族是HOX和分化相关蛋白的重要调节因子。

（四）NSD1／2

组蛋白赖氨酸N－甲基转移酶NSD2／MMSET，在15％～20％多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者基因组［t（4；14）（p16.3；Q32）］中作为重排靶标。这种易位导致NSD2表达异常升高，这显示NSD2可能是致癌基因。随后的工作表明，在MM KMS11细胞系中敲低NSD2会导致细胞凋亡而重新过表达的野生型NSD2，促进细胞增殖。此外，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）过表达野生型NSD2足以转化肿瘤细胞。在功能上，NSD2能够催化非甲基H3K36到一甲基化或二甲基化的形式，并伴随H3K27me3的降低，这是NSD2在致癌重新编程发挥作用的主要机制。事实上，另一项研究显示NSD2SET催化活性是几个致癌通路（TGFA、MET、PAK1、RRAS2）转录激活必需的。在NSD2突变的肿瘤中还发现几种生物学通路发生显著改变：TP53通路、细胞周期、DNA修复、黏着及Wnt信号。

近日，测序揭示了NSD2（E1099K）在7.5％儿童B－ALL和其他淋巴组织肿瘤中具有高度回复突变。在软琼脂实验中的研究表明，NSD2E1099K增强克隆形成、H3K36me2增加和H3K27me3减少。这一新发现有令人兴奋的治疗潜力。此外，甲基化转移酶NSD1在多种肿瘤也发现有突变，包括HNSCC和AML。

（五）去甲基化酶（KDM）－KDM6A

在KDM中首批鉴定到的与肿瘤相关的基因突变是在1 390名患者肿瘤样品测序中鉴定到的KDM6A突变。值得注意的是，KDM6A突变被发现普遍存在于固体和液体肿瘤，包括AML、CML、T－ALL、MM、霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）、移行上皮细胞癌（transitional cell carcinoma，TCC）、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、子宫内膜、GBM、小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）、非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）和RCC中。KDM6A突变也已发现在其他肿瘤如前列腺癌、髓母细胞瘤及腺样囊性癌。虽然这些突变在大多数肿瘤中发生频率很低，但是在膀胱癌是相当常见的（20％～29％）。此外， KDM6A突变出现在膀胱癌早期，突变频率与发展阶段成反比。因此，KDM6A失活可能是膀胱肿瘤发生早期的一个较为重要的驱动突变。然而，KDM6A突变是否能够成为肿瘤预后评价指标尚未确定。

KDM6A具有1 401氨基酸，含有数个TPR结构域和1个JMJC结构域，它是一类含JMJC结构域的H3K27me3去甲基化酶。早期的测序工作表明，大部分KDM6A突变主要是移码突变或者无义突变且多数发生在JMJC结构域之前，最有可能导致酶活丧失，也因此被认为是潜在的抑癌基因。为了检验这一假设，研究者在KDM6A缺失的细胞系中重新表达野生型KDM6A，并观察到细胞增殖显著的降低，但酶活缺失型的过表达则没有这样的功能。在肿瘤中H3K27的甲基化失调可能会导致严重的后果，因为在分化过程中H3K27去甲基化HOX基因是必需的，而不能正常激活HOX基因则会导致分化受阻。除了调节HOX基因，KDM6A的催化活性也可以通过HBP1活化RB通路基因，从而进一步影响分化和细胞周期调控。

（六）其他去甲基化酶

虽然KDM6A突变是去甲基化酶中最普遍和研究得最细致的，其他一些去甲基化酶在肿瘤中也鉴定到显著的突变，尽管频率比较低。与众不同的是，RCC中有许多去甲基化酶的突变，包括KDM1A、KDM2B、KDM3A、KDM3B、KDM4A／B和KDM5C。这些去甲基化酶的自然功能还未知，但这些研究结果显示KDM1A、KDM4A－C和KDM5B是潜在的致癌基因，而KDM6A／B和KDM3B／C则可能是抑癌基因。另外，KDM2A／B和KDM5A在某些情况下，可能分别具有致癌和抑癌作用。然而，到目前为止，在去甲基化酶基因中还未鉴定到获得性功能突变。

三、组蛋白乙酰化

组蛋白尾巴上的赖氨酸残基也可能通过增加一个乙酰官能团产生另一种共价修饰。这个过程导致了赖氨酸残基上的电荷中和，并削弱了组蛋白和带负电荷的DNA之间的静电相互作用。因此，人们认为组蛋白乙酰化作为一个基因转录激活的“标志”，所产生的主要的结果就是一个更加“开放”的染色质结构。现在，多项“染色质免疫共沉淀技术测序”研究已经证实了这一点，发现组蛋白乙酰化的位点多发生在增强子、启动子，甚至于活跃基因的整个转录区域。此外，它可以直接改变染色质的状态，这些具体的组蛋白“标记”进一步招募“阅读器”类别（Bromo或是PHD结构域）的重塑因子。

组蛋白乙酰化是由赖氨酸乙酰转移酶［K（lysine）acetyltransferase，KAT］催化的，其主要分为在细胞核中作用的A类及在细胞质和游离的组蛋白上作用的B类。组蛋白乙酰化水平同时也被HDAC调节。有趣的是，这些酶也能够修饰其他的非组蛋白（包括p53，Rb和MYC）并可以作为转录辅助因子。因此，乙酰化调控以多种方式参与肿瘤的发生。

（一）乙酰化转移酶（CREBBP和EP300）

CREB结合蛋白（CREBBP）和E1A结合蛋白p300（EP300）具有广泛的底物选择性，能够在体外乙酰化所有4种组蛋白。事实上，这两种蛋白是高度保守的，在氨基酸水平上同源性为63％。因此，它们的许多功能相似，包括通过犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）的活性进行染色质修饰，将关联的蛋白质（p53和Rb，E2F）乙酰化，以及作为转录因子和其他转录机制的支架能力。尽管乙酰化是一类最早发现的表观遗传修饰，它们的生物学功能才刚刚开始被理解。

CREBBP和EP300都被发现与肿瘤息息相关，20世纪90年代中期，研究发现阔拇指巨趾综合征（Rubinstein－Taybi syndrome）存在CREBBP杂合突变，这是一种发育障碍症，并伴随着包括白血病和淋巴瘤在内的肿瘤的发病率增加。大约在同一时间，EP300被发现可以结合E1A病毒癌蛋白，证明发挥肿瘤抑制子的功能。随着基因组学时代的到来，在越来越多的肿瘤中发现了这两种蛋白的突变。例如，CREBBP突变发生在非霍奇金淋巴瘤（NHL；21％）、DLBCL（29％）、FL（32.6％）、TCC（13％）、腺样囊性癌（ACC；7％）和复发性ALL（18. 3％）；EP300突变发生频繁略低，发生于NHL（7％）、DLBCL（10％）、FL（8.7％）、TCC （13％）、ACC及复发性ALL。有趣的是，这两种基因的突变是相互排斥的，这表明它们功能的冗余性，至少部分情况下是这样的。此外，鉴定到的大多数突变是杂合的，这表明这两个基因很可能是单剂量不足的肿瘤抑制基因，在小鼠模型上也证明了这一点。与此同时，突变强烈集中在KAT催化结构域，其中一些突变使得其体外对于H3K18及非组蛋白底物BCL6和p53的乙酰转移酶活性降低。因此，乙酰转移酶活性的破坏很可能是肿瘤形成的主要因素。

尽管研究者们发现了这些肿瘤特异性突变，但其导致癌变的机制仍然不清楚。例如，在SCLC中，CREBBP／P300突变虽然导致了体外酶活性降低，但并没有导致明显的基因表达改变。由于CREBBP和p300的功能多样性，一些突变可能通过其他机制产生表型。例如，最近的研究表明，这两种蛋白在双链断裂（double－strand break，DSB）位点对组蛋白H3和H4具有乙酰转移酶特异性，促进SWI／SNF染色质重塑复合体的招募。最近，也有对于CREBBP／EP300相反功能的报道。例如，EP300实际上在黑素瘤细胞系中上调，抑制KAT活性，降低了黑素瘤细胞的生长。因此我们需要进一步研究确定这两种蛋白的功能机制。

（二）Erasers（HDAC）

HDAC的家族有四大类：Ⅰ类（细胞核），Ⅱ类（细胞核和细胞质），Ⅳ类（催化活性需要锌离子）。Ⅲ类（sirtuins）在缺乏锌的条件下具有催化活性，与其他HDAC几乎没有同源性。与乙酰转移酶相反，HDAC家族的18个成员负责从组蛋白尾巴上的赖氨酸残基除去乙酰化基团，同时，HDAC也可以去乙酰化非组蛋白底物。

研究发现HDAC与肿瘤的发生有关。功能实验表明，这些HDAC是促原癌基因，敲除后细胞凋亡增加，增殖减少（Ⅰ类），血管发生和细胞迁移降低（Ⅱ级）。最重要的是，这一功能与作为乙酰转移酶对应物相一致，乙酰转移酶被归于肿瘤抑制子。

因为HDAC在许多细胞背景下是原癌基因。因此，在过去10年中，在开发HDAC的靶向抑制剂方面已做了大量工作。伏立诺他是美国食品与药品监督管理局（FDA）批准的第1个HDACi，现已用于治疗特定肿瘤，其他更具选择性的HDACi在早期试验中对减少细胞生长和促进细胞凋亡显示出很好的效果。与此同时，近年来也有HDAC2（结肠）、HDAC4（乳腺）和HDAC9（前列腺）突变的报道，这可能影响HDAC抑制剂治疗的有效性和患者的预测总体反应。最近研究表明，促凋亡基因APAF1很可能是HDAC2的抑制靶标，这为HDACi的疗效和在HDAC2突变细胞中的耐药性提供了明确机制。

四、染色质重塑

除了通过组蛋白末端共价修饰调控基因表达，ATP依赖性的染色质重塑子也塑造染色质结构，影响基因表达模式。几种多单元效应子具有该功能，包括SWI／SNF、ISWI、INO80、SWR1和NURD／MI2／CDH复合物。在过去的几年中，研究发现SWI／SNF复合物的组成蛋白在肿瘤中经常失活，后续研究证实它们是表观遗传抑癌因子。

（一）SWI／SNF复合物

SWI／SNF复合物由1个或2个不同时出现的催化性ATP酶（SMARCA2／BRM或SMARCA4／BRG1）、一组保守的核心亚基（SMARCB1／SNF5、SMARCC1／BAF155、SMARCC2／BAF170）和其他不同的亚基组成。BAF和PBAF复合物是2种重要的与肿瘤相关的SWI／SNF复合物，分别包含不同时出现的ARID1A或ARID1B亚基和PBRM1或BRD7亚基。SWI／SNF复合物通过滑动或插入组蛋白八聚体的方式使核小体平移，从而重塑染色质。通过这些机制，SWI／SNF复合物对转录调控具有重要功能，通过协调关键基因的表达在发育中发挥作用。

（二）AT富集的交互式结构域

AT富集的交互式结构域（ARID）基因超家族由7名成员（ARID1～ARID5）组成，其中与肿瘤有关的有：ARID1A／BAF250a、ARID1B／250B和ARID2／BAF200。ARID1A突变被报道得最多，具有很高的突变率。ARID1突变最先发现于卵巢透明细胞癌（ovarian clear cell carcinoma，OCCC；50％）和子宫内膜癌（30％）。随后，在其他多类肿瘤，包括髓母细胞瘤、乳腺癌、肺腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌和神经母细胞瘤也都发现ARID1基因的突变。有趣的是，大多数ARID1突变都是杂合性的，均匀分布在编码区，导致产生被截短的蛋白产物。这表明它可能是单剂量不足的肿瘤抑制基因。功能研究证实，ARID1A部分敲除后细胞增殖和菌落形成增加、分化受损、细胞凋亡降低。ARID1B和ARID2的突变也有报道。ARID1B突变发生在神经母细胞瘤（7％）和肝细胞癌（HCC）（6.7％），在乳腺癌、胃癌和胰腺癌中也存在散发性突变。这些突变通常发生移码和杂合性突变，表明它可能像ARID1A一样是一种肿瘤抑制子。更有趣的发现是，ARID2基因突变在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）相关的HCC（14％）和相对于所有类型HCC（5.8％～6.5％）具有较强的富集性。

关于ARID1A失活如何通过SWI／SNF染色质重塑导致细胞恶性转化的机制目前尚不清楚。已知，ARID1A和ARID1B对于SWI／SNF特异性招募很重要，该过程部分依靠ARID结构域与DNA非特异性结合。更重要的是，ARID1A的C末端附近存在几个核激素受体结合位点，ARID1A可能通过结合核激素受体帮助SWI／SNF特异性招募。由此可见，在激素敏感的肿瘤（卵巢癌、乳腺癌）中ARID1A基因突变普遍发生可能不仅仅是巧合。在干扰素信号响应中，ARID2似乎通过结合到干扰素（IFN）诱导的启动子区域使染色质重塑，从而调节抗增殖信号。如果这样，ARID2突变可能在HCV感染过程中使得IFN相关的免疫过程丧失功能，从而加速肿瘤发生。

（三）SMARC

SWI／SNF相关的基质关联的肌动蛋白依赖的染色质调节子（SMARC）基因，也称为BRG1相关因子，是肿瘤中被描述最清楚、突变最频繁的染色质重塑子之一。这些基因编码数种SWI／SNF蛋白质，包括催化性ATP酶亚基（SMARCA2或SMARCA4）、保守的核心亚基（例如，SMARCB1、SMARCC1和SMARCC2）和变体亚基（例如，SMARCE1）。

SMARCB1在几乎所有横纹肌肿瘤（一种常发于幼儿的肿瘤）中（98％）通过双等位基因突变、缺失和变异（截短、错义）失活。最近，外显子组测序数据发现其他肿瘤和恶变前损伤中发现该基因突变，如肉瘤、胃癌、脑膜瘤、脊索瘤和肝母细胞瘤。在SMARCB1缺失的小鼠模型中已经验证该蛋白质具有肿瘤抑制作用。有趣的是，在SWI／SNF ATP酶SMARCA4S缺失的情况下MARCB1缺失小鼠不形成肿瘤，这表明SMARCB1失活引起的肿瘤发生是由于包含SMARCA4的SWI／SNF复合物的残基活性异常引起的。此外，SMARCB1失活引起的全局H3K27me3改变可能直接导致肿瘤发生，因为EZH2的同时缺失会阻止肿瘤发生。进一步的机制研究发现了众多SMARCB1下游靶标，包括RB、P16、细胞周期蛋白D1及MYC，这些证据在SMARCB1失活肿瘤中提供了必要的机制和可能的治疗靶标。

SMARCA4，两个SWI／SNF ATP酶亚基之一，最先发现在15％～50％的非小细胞肺癌（NSCLC）中表达缺失。SMARCA4突变也发生在35％的NSCLC细胞系中，以及髓母细胞瘤、Burkitt淋巴瘤、黑素瘤、肝癌、RCC、HNSCC、非典型性畸胎样横纹肌肉瘤（atypical rhabdoid／teratoid tumor，AT／RT）、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌。大多数突变和缺失都是纯合的，虽然1个等位基因的缺失就足以驱动肿瘤发生。例如，10％的SMARCA4杂合性突变小鼠发展成乳腺肿瘤，并没有第2个等位基因缺失。功能性研究发现，SMARCA4在细胞分化和细胞黏附／迁移方面扮演双重角色，可用于调节细胞迁移和降低潜在的入侵。

SMARCA2是SWI／SNF复合物的另一个ATP酶亚基，是一个通过表观遗传沉默和突变失活经常性表达缺失的肿瘤抑制子。小鼠模型研究已经表明，SMARCA2缺失导致细胞增殖异常，包括整体重量提高和组织特异性生长增加。这些小鼠表现出雄激素不依赖的前列腺细胞过度增殖。在肺模型中，SMARCA2的杂合或纯合缺失导致肿瘤形成。其他研究已经提出了另一种SMARCA2或SMARCA4缺失导致致瘤性增强的机制，特别是通过转录因子ZEB1诱导上皮－间质转化（EMT）。尽管表观遗传沉默是SMARCA2失活的主要机制，某些特定突变也被证明在某些肿瘤的发病机制中发挥重要作用。最近，研究者们通过对60位ACC患者的全外显子组和全基因组测序发现SMARCA2体细胞非同义突变（5％）。所有这些突变发生在编码解旋酶C结构域区域，该结构域参与基因转录调控。其他SMARCA2突变也已在另一组群的黑素瘤患者中被报道。

（四）PBRM1／BAF180

PBRM1具有乙酰化识别子功能，包含可结合乙酰化组蛋白的6个串联Bromo结构域，还有2个可介导蛋白－蛋白相互作用的苯芳香羟化酶（BAH）结构域及1个结合核小体DNA的高迁移率族（HMG）结构域，该因子是SWI／SNF重塑子中的特异组分。

在29％～41％的透明细胞性肾细胞癌（CCRCC）患者中都有PBRM1／BAF180突变，已知的突变位点均匀地分布在编码区，多为移码和无义突变，可导致截短的蛋白产物，因此推测这些突变是失活突变。功能学研究证实，野生型的PBRM1蛋白可结合在CDKN1A／p21基因的启动子区，帮助p21转录活化，从而调控细胞周期（G1阻滞）。在CCRCC中，PBRM1突变与较差的肿瘤临床特征相关联。例如，携带有PBRM1突变的患者更多地表现为Ⅲ期或Ⅳ期疾病，瘤体较大，分化程度低，肾周增加或淋巴管浸润。

此外，PBRM1的较低频率的突变也已在其他许多肿瘤中被发现，包括DLBCL、HNSCC、CLL、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。

（五）BRD7

BRD7是一种在乳腺癌中频繁缺失的PBAF特异性染色质重塑子。最近，这种基因的低频率突变在数种肿瘤中已被发现。在一段时间，BRD7被认为是一种主要与p53共结合激活原癌基因诱导的衰老（oncogene－induced senescence，OIS）且重要的SWI／SNF肿瘤抑制子。事实上，BRD7最早在功能确证筛选中作为p53依赖的OIS所需基因被发现。研究中发现p53的几个靶基因的诱导需要BRD7，包括CDKN1A和MDM2，同时BRD7具有抑制细胞周期从G1进入S期的能力。此外，最近的一项对于上皮性卵巢癌的研究显示，BRD7可以独立于p53活性作为肿瘤抑制子，这可能是通过螯合细胞质中的β连环蛋白起作用。研究还发现，BRD7在肿瘤细胞中的过表达有着强大的肿瘤抑制效果，导致细胞活力降低和侵袭／迁移减少。

五、组蛋白

除了上文提及的表观遗传调控因子的突变，近年来的研究还发现了组蛋白基因本身的重复突变。在结肠癌（HIST1H1B，4％）和NHL（HIST1H1C，7％）中的连接组蛋白H1的突变是首先发现的组蛋白突变，但该突变频率很低，无重复性。而随后在小儿脑胶质瘤中发现的HIST1H3B和H3F3A（编码组蛋白H3.1和H3.3）的突变则有很高的重复性，并表现为杂合性。其中H3F3A突变高频发生在弥漫性内在脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG；78％）和小儿GBM（22％～31％）中，其主要的突变位点是氨基酸残基K27M和G34（G34／R和G 34／V）。有趣的是，这些位点的突变可改变发生在该残基本身或是附近的表观遗传修饰，如H3K27me3和H3K36me3。另有研究发现，G34位的突变可以影响H3. 3K36me3识别子ZMYND11对 H3.3K36me3的识别。另外，在小儿软骨母细胞瘤（chondroblastoma）还发现了H3F3A和H3F3B基因中的K36M突变，该突变可直接导致突变的H3.3缺失K36甲基化。

针对K27M突变的研究发现，该突变可绑定H3K27甲基化酶体PRC2，从而抑制了PRC2在全基因组水平上的催化活性，导致H3K27me3的全面显著下调，并引起DNA甲基化分布的紊乱。现在推测，这些表观遗传紊乱会导致下游基因表达及分化途径的出错，从而引发癌变。

目前研究已清楚表明，表观遗传修饰子突变在肿瘤中具有令人难以置信的多样性和广泛性。事实上，测序数据显示，基因中存在的突变几乎涵盖了表观遗传学的所有方面，包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰和染色质重塑。几种肿瘤通过或至少部分通过被改变的表观遗传组［例如，低程度胶质瘤（low grade glioma，LGG）中的IDH1／2，FL中的MLL2，RT中的SMARCB1］，依靠少数但功能强大的基因突变驱动肿瘤发生。值得注意的是，一些肿瘤中染色质修饰子的改变非常广泛和普遍（ACC、CCRCC和TCC），它们主要通过表观遗传途径驱动。DNA甲基化调节子的突变具有强大的肿瘤特异性（胶质瘤、白血病），而组蛋白修饰子的基因突变（如KDM6A）在许多肿瘤中广泛存在，然而这种意义并没有被完全理解。

尽管肿瘤表观遗传学领域相对较新，表观遗传调节基因中的驱动突变的发现已经使得预后和治疗取得了新进展。已被发现的新的肿瘤亚型，或以前不知道的基因突变，使治疗方法更具差别性。此外，数种新的靶向治疗药物目前正在开发中，并很有希望逆转某些基因活化突变（例如，IDH1和EZH2）引起的表型。此外，即使驱动突变无法被直接靶向（例如，HDACi和DNMT抑制剂），理解这些突变背后的表观遗传机制为治疗提供了新的潜力。

毫无疑问，我们处在肿瘤基因组学和表观遗传学快速发展的时代。对于这两个领域交叉部分的研究清楚解释了肿瘤生物学的许多方面，并发现了肿瘤发生的许多新机制。目前，在将这些早期发现转化为临床实践的道路上已快速前进，染色质修饰基因新突变的发现正在迅速加快。随着新的表观遗传学疗法的不断发展，至少在某些肿瘤上，在不久的将来会出现大幅改善的疗效。此外，对表观遗传改变与驱动基因突变关系的更进一步理解可能会发现参与肿瘤发生的新途径，或许它们可以被用来作为治疗干预肿瘤的新靶标。

六、表观遗传药物在肿瘤治疗中的应用

肿瘤的发生过程中伴随着大量遗传突变和表观遗传变异。如上文所述，近年来的肿瘤基因组测序项目中发现了大量表观遗传因子的突变，说明表观遗传紊乱会导致肿瘤的发生和发展。然而与遗传突变不同，表观遗传变异主要导致染色质结构异常和下游基因转录失调。特别是在细胞分化过程中的关键节点，表观遗传的变异可能会引起正常的分化过程失控。例如，细胞去分化成为恶性细胞，成体干细胞不能正常分化转变为肿瘤干细胞，多分化途径中的某种途径分化受阻而导致另一种途径的分化过量等。由于表观遗传变异的可逆性，通过药物调节相关的表观遗传通路可能恢复这些变异，从而达到治疗肿瘤的效果。正是基于这种科学假想，近15年来，大量的表观遗传药物被开发并进入临床。其中有一部分药物由于较好的疗效，已通过FDA和国家食品药品监督管理局（SFDA）的审批，而另一些还处在临床试验的早期阶段。本节将讨论针对DNA甲基化、组蛋白甲基化酶、HDAC、HDMT，以及乙酰化识别子所开发的小分子抑制物在肿瘤治疗中的应用和前景。

（一）第1代肿瘤表观遗传靶向性药物

1.DNA甲基化抑制物在肿瘤中的应用 DNA甲基化是最早被关注的表观遗传修饰之一。如前所述，它是指经DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）催化胞嘧啶形成5－hmc的过程。在高等脊椎动物中DNA甲基化一般发生在CpG位点（即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）。基因组中的部分CpG会成簇存在，形成富含胞嘧啶和鸟嘌呤的区域，又被称为CpG岛。已知，人类基因组中有1％～2％的序列是CpG岛，分布在半数以上的基因启动子区域附近，并且CpG岛的甲基化状态与其附近基因的转录活性成反比。而处于CpG岛以外的CpG双核苷酸主要分布于重复区域或是中性粒附近，剩下的CpG则分布于基因区或是基因间区。

在正常组织中，绝大多数CpG位点（80％～90％）已被甲基化，特别是CpG岛以外的CpG位点，但大部分的CpG岛区则体现出低甲基化状态。然而在肿瘤研究中发现，肿瘤组织中的DNA甲基化的特点是甲基化分布失衡，即全基因组水平上的低甲基化伴随着局部CpG岛的高甲基化。一般认为，这些高甲基化的CpG岛通过两种方式影响下游基因的表达：①CpG岛甲基化后抑制转录因子的结合，导致基因不能被正常激活；②甲基化的DNA特异性招募一些识别子，如MBD3和MeCP2等，来抑制下游基因的转录。研究发现在肿瘤中，很多抑癌基因的失活与其启动子区CpG岛的DNA甲基化相关，如P15INK4b、P16INK4a、P14ARF、CDH1及EXT1。由于与正常组织有明显差异，不同的肿瘤中特征性的CpG岛甲基化还可以作为有效的肿瘤检测手段，如P15Ink4b的甲基化可以作为诊断白血病及治疗的检测手段，而P16INK4a、P14ARF、RASS1F、MGMT、TIMP3的甲基化则是结肠癌的特征。另一方面，肿瘤中的全局DNA低甲基化的直接结果就是很多重复序列处（如SINE和LINE）的甲基化丢失，并造成这些地方的异常活化及基因组不稳定性，也间接导致肿瘤的高突变率。

正是由于表观遗传变异的可逆性，研究者认为由DNA甲基化造成的抑癌基因失活现象可以通过抑制DNA甲基化的方式重新恢复，而早期的大量实验也证实了这一点。现在已有的DNA甲基化抑制物主要分为两大类：核苷类似物（nucleoside analogs）和非核苷抑制物（non－nucleoside inhibitor）。前者的结构类似于核苷酸并已经被研究了很多年，而且已有被FDA认证的药物；而后者的结构则有很多种。下面将只讨论核苷类似物的作用机制及其临床应用。

最早发现的DNA甲基化抑制物是5位氮杂（5－Aza）胞嘧啶类似物，如5－azacytidine （azacitidine）和5－aza－2′－deoxycytidine（地西他滨，decitabine）。在1968年，这两类化合物首先被作为抗代谢和细胞毒性药物应用在小鼠白血病模型的化疗实验中。在1977年和1978年，P.G.Constantinides和P.A.Jones等人发现了其抑制DNA甲基化的功效，并发现其可促小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1／2C18分化为有功能的肌管细胞。虽然在当时，研究者还不清楚表观遗传如何参与调控细胞分化，但是这些却可能是人为干扰表观遗传信号以影响细胞分化并抑制癌细胞生长的最早的实验证据。

在分子层面上，这些5－Aza胞嘧啶类似物都是在其类胞嘧啶环的5位以氮原子（N）替代了胞嘧啶环中可被甲基化的碳原子（C），由于其核糖环的不同可以分为脱氧核糖核苷或是核糖核苷两种类似物。当这些5－Aza被运输入细胞中后，它们会首先被磷酸化成三磷酸化的活性状态，并且在DNA／RNA合成过程中被聚合酶误认为是（脱氧）核苷酸单体而掺入到正在合成的DNA或RNA链中。当掺入到新合成的DNA链中后，5－Aza胞嘧啶类似物也可以被DNMT误识别为正常的胞嘧啶，并试图在其碱基的5位氮原子上加上甲基。然而加上甲基后，由于不能发生随后的β消除反应，DNMT的活性中心的半胱氨酸的巯基无法从6位的碳原子上解离，从而被共价绑定在5－Aza胞嘧啶环上。这样的共价绑定不仅限制了DNMT酶对其他位点的催化，还启动了细胞内的蛋白降解程序，使得5－Aza处理后的细胞内DNMT酶水平大大下降，从而导致整体的DNA甲基化水平的下降。大量实验证实，5－Aza处理后的癌细胞中，很多异常沉没的抑癌基因的表达水平会得到恢复，并伴随着肿瘤细胞的死亡。特别需要注意的是，高浓度的5－Aza可造成非特异性的细胞毒性，并直接阻碍细胞周期。因此，在高浓度药物处理下，DNA合成受阻，反而影响了5－Aza药物掺入到DNA新链中的效率。也因此，早期的临床试验效果并不十分理想。近年来，临床上为了更有效地达到抑制DNA甲基化的效果，一般都是在低浓度时使用阿扎胞苷（5－azacitidine）药物。

在2004年和2006年，FAD分别批准了对MDS和AML及CMML患者使用阿扎胞苷。与其他药物（特别是HDAC抑制物）的联合使用目前还处于临床实验阶段，特别是在非小细胞肺癌中的初步探索中还获得了很有前景的结果。此外，在黑素瘤、卵巢癌及前列腺癌中使用5－Aza也已经进入临床2期了。尽管5－Aza对肿瘤细胞有很强的杀伤性，但是这些类似物的口服有效性差、不稳定性及细胞毒性都限制了它们更广泛的使用。也正因为这些原因，更稳定的第2代5－Aza类似物（CP－4200和SGI－110）也应运而生。现在SGI－110在MDS和AML治疗中的应用也已经入临床2期实验。

特别要指出的是，5－Aza类似物的药效是通过掺入到新合成的DNA和RNA链，诱导DNMT共价绑定并被降解来达到的，所以它们并不是真正意义上的DNMT抑制物，而且常伴随有很强的非异特性副作用。为了解决这个问题，多种非核苷酸类抑制物也正处于研发阶段。但由于研究还处于早期，还未进入临床实验阶段。

2.HDAC抑制物在肿瘤治疗中的应用 HDAC通常分为两大类：Zn2＋依赖性酶和NAD＋依赖性酶。前者又细分为3种亚型（Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型），包括HDAC 1～HDAC 11；后者（Ⅲ型）则由SIRT 1～SIRT 7组成。

实验证明，细胞内的组蛋白乙酰化的水平受到HAT和HDAC的高度动态调控。因此， HDAC抑制物可有效地快速提高全局组蛋白乙酰化水平。组蛋白赖氨酸乙酰化可中和赖氨酸残基所携带的正电荷，从而改变局部组蛋白与DNA分子结合的强度。因此，HDAC抑制物处理会形成较为疏松的染色质，并打开一些沉默基因的转录。近年来的研究还发现，细胞内有大量非组蛋白蛋白可发生乙酰化修饰，如转录因子和大量代谢酶，而这些非组蛋白乙酰化也受到HDAC抑制物调控。但是HDAC抑制物对于不同靶蛋白的活性调控却是不同的。例如，p53和GATA－1的活性会随乙酰化的提高而提高，而T细胞因子和其辅助活化因子活化蛋白受体（ACTR）的活性则相反，会被抑制。研究发现，HDAC抑制物可有选择性地恢复部分抑癌基因的表达或是改变靶蛋白的活性，从而产生对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。基于临床试验的结果，FDA已经通过在表皮T细胞淋巴瘤（CTCL）的治疗中使用两类HDAC抑制物［2006年的抗肿瘤药伏林司他（vorinostat）和2009年的抗肿瘤药罗米地新（romidepsin）］。在2015年，SFDA也在中国批准了在胰腺癌的治疗中使用西达本胺（chidamide）。由于HDAC抑制物对多种肿瘤细胞均有杀伤力，现在还有大量HDAC抑制物处于临床1期和2期试验阶段。需要提及的是，这些已通过的和正在临床试验过程中的HDAC抑制物主要都是针对Zn2＋离子依赖性的HDAC所设计的，而NAD＋依赖性的SIRT靶向性药物还很少见。

类似于DNA甲基化抑制物，HDAC抑制物也会影响全局水平的组蛋白乙酰化。由于在不同组织中影响的下游基不同，不同肿瘤对HDAC抑制物的响应也不同，因此不能预测合适的患者群体也是HDAC抑制物难以广泛使用的主要原因之一。此外，现有的HDAC抑制物主要是通过螯合活性中心的Zn2＋离子来达到抑制HDAC的效果。虽然Zn2＋依赖性的人类HDAC 1～HDAC 11分为3类亚家族，但由于它们的活性区结构类似，现有的HDAC抑制物对不同HDAC的选择性较差（特别是Ⅰ型和Ⅱ型HDAC），常常同时抑制多个HDAC蛋白，不可避免产生不良反应。所以，HDAC抑制物的另一个特点是在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤正常细胞，有很强的不良反应。

（二）第2代肿瘤表观遗传靶向性药物

如上文所述，第1代表观遗传药物DNA甲基化抑制物和HDAC抑制物，在整体水平上改变DNA甲基化和组蛋白（也包括非组蛋白）乙酰化水平，虽然可杀伤肿瘤细胞，但也有很强的细胞毒性。为了寻找更加特异性的表观遗传药物，自2007年以来，人们更多地将目标转向组蛋白甲基调控酶及表观遗传识别子。与DNA甲基化酶和HDAC家族相比，组蛋白甲基化酶和去甲基化酶家族的组成成员更多，调控体系更为复杂和精细。据估计，人类基因组编码的组蛋白甲基化酶的数目大约有50种，去甲基化酶的数目有20多种，而表观遗传识别子的数目则更多，仅以乙酰化识别子BROMO结构域为例，就有70多种并至少可分为8个亚家族。最近5年来的多篇报道证实了这些表观遗传因子都有很好的成药性，而且由于其调控体系更为精细，因此推测以它们为靶点设计的药物可能会达到比第1代表观遗传药物更好的特异性。下面将简要讨论近年来在该方向的一些最新进展，包括两类刚进入临床1期的表观遗传靶向性药物，EZH2抑制物和BET抑制物。

1.第2代表观遗传学靶点的成药性 在该领域中，学术界及各制药公司已经对甲基化酶、去甲基化酶、识别子的成药性有所研究。根据已公布的信息，各大类靶点的成药性均已经得到较好的解决，尤其是甲基化酶和BROMO识别子家族靶点，包括已进入临床1期试验的甲基化酶EZH2、DOT1L和BROMO识别子中的BET家族的小分子药物。而在去甲基化酶方面，LSD1、KDM4及KDM6家族的抑制物也分别有文章报道。这些先期结果均证实这几类药物靶点有着很好的成药性。

2.甲基化酶DOT1L和EZH2与肿瘤的相关性 甲基化酶DOT1L和EZH2在AML和DLBCL有着很强的疾病相关性。DOT1L是细胞内唯一的组蛋白H3K79位的甲基化酶，也是白血病中常见的致癌融合蛋白MLL－AF4、AF9和AF10的结合蛋白。研究发现，DOT1L会被这些致癌融合蛋白带到HOXA基因簇区域，而它的H3K79me3甲基化酶活性会导致HOXA基因编码区获得过高的H3K79me3修饰，并引发HOXA9等基因的异常过量表达，最终导致病变。令人兴奋的是，通过基因剔除和小分子抑制物抑制DOT1L的功能可有效阻止肿瘤生长。目前有一类DOT1L药物正在进行临床1期试验，并发现有少量患者的肿瘤生长得到抑制，然而它的疗效还需要更多患者的数据以确认。

EZH2是体内最主要的H3K27me3甲基化酶，也广泛参与生物体发育分化的调控。EZH2活性过高常见于多种肿瘤，包括脑胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌及多种血液肿瘤。2010年，高通量疾病基因组测序研究在12％的弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中发现了EZH2氨基酸Y641位点和A667位点的获得性突变。这些突变改变了EZH2的底物选择性。研究发现，突变体EZH2可更高效地将H3K27me2转化成为H3K27me3，并导致肿瘤组织中H3K27me3的水平大大提高；而EZH2的小分子抑制物可有效抑制细胞内的H3K27me3的水平，并对部分肿瘤细胞产生特异性杀伤。在部分细胞株试验中发现，抑癌基因P16INK4A的表达水平在EZH2药物处理后明显提高，从而导致细胞周期阻滞。但需要提及的是，并不是每一种对EZH2药物敏感的细胞中的P16INK4A都会在药物处理后上调。因此，EZH2药物真正的抑癌机制还不十分明确。重要的是，2014年的临床1期结果已发现EZH2抑制物不仅可被患者在安全剂量内耐受，并在多个患者中已经表现出抑制肿瘤生长的效用，但其药效和EZH2基因的突变状态的关联还需通过更多临床样本来证实。

3.去甲基化酶及赖氨酸特异性脱甲基酶（LSD1）与肿瘤的相关性 去甲基化酶是一类较晚才发现的表观遗传学调控因子。由于组蛋白甲基化是一种很稳定的修饰，在很长一段时间内，学术界一直质疑去甲基化酶的存在。直到2004年，哈佛大学施扬实验室中发现了第一个去甲基化酶LSD1／KDM1A。随后的2006～2010年4年间，近20种去甲基化酶陆续被发现。现在所知的去甲基化酶大约有20种，分为7个蛋白家族。虽然发现较晚，但是去甲基化酶的重要生物学功能，特别是与疾病的相关性，也已经逐渐被学术界所认识。

LSD1是第一种被发现的去甲基化酶，针对其的研究也是在去甲基化酶中最为全面的。它是细胞内的一种极为重要的转录调节因子，参与多种生物学过程，如雌激素受体和雄激素受体介导的转录活化、DNA损伤修复及神经组织相关基因在非神经组织中的转录抑制。更为重要的是，2012年，研究者发现LSD1会参与部分白血病细胞的去分化过程中，而使用RNAi干扰和小分子抑制物在细胞内抑制LSD1活性可以大大刺激全反式维A酸（ATRA）处理后的细胞分化。这项发现提示，那些对ATRA治疗不敏感的患者（主要是non－APL AML，占AML的80％～90％）可以使用LSD1抑制剂作为辅助治疗。现在已有多种LSD1抑制物被公布，有可逆性的，也有不可逆性的抑制物。公布的LSD1抑制物的细胞活性均不够理想，但是已经显示较好的抑制肿瘤的活性。

另外，还有多种去甲基化酶，如KDM2B和KDM5A。近年来发现其与多类肿瘤的发生或是耐药性的形成高度相关。因此，去甲基化酶的重要性也在制药界逐渐被认可，以去甲基化酶为靶点的靶向性药物在未来几年内很可能会进入临床试验阶段。

4.识别子和BET家族蛋白与肿瘤的相关性 表观遗传修饰的识别子主要分为识别酰基化和甲基化修饰两大类。酰基化修饰的识别主要由BROMO结构域所介导，而甲基化修饰主要由PHD、WDR40、CHROMO和TUDOR所介导完成。虽然这些识别子不直接参与染色质修饰的化学发生过程，但是它们在解读染色质修饰所传递的生物学意义的过程中发挥很大的作用。多年来，由于制药界更加青睐有催化酶活性的药物靶点，如HDAC和HMT类，很多识别子的药用价值一直被忽略。直至2010年的两篇关于BROMO结构域的BET家族小分子抑制物的文章发表，人们才开始逐渐认识到它们的药用价值。

目前已知BET家族蛋白（BRD4，BRD2和BRD3）是转录活化时的关键因子，通过结合乙酰化的组蛋白而作用在基因的启动子区及附近的增强子区。最近的研究发现，由于原癌基因MYC的转录水平极大地依赖于其增强子的活性，而BET家族蛋白对于MYC基因的增强子的活化起到关键作用。当BET家族的活性被小分子药物抑制的时候，MYC转录活性大大下调，其蛋白水平也随之显著降低，从而导致依赖于MYC蛋白的血液肿瘤细胞的特异性死亡。已有多家公司开发BET家族的小分子抑制物，最早的BET家族药物已在2014年进入临床1期实验（针对MM）。2015年公布的一期数据也非常振奋人心，数据表明患者对该药物有很好的耐受力，且部分患者的肿瘤在服用药物后有明显缩小。

与传统的激酶靶向性药物相比，表观遗传药物是通过改变肿瘤细胞的表观遗传谱，进而改变染色质结构和下游基因转录水平来达到抑癌作用的。第1代表观遗传药物的设计主要是针对DNA甲基化和HDAC。由于体内的DNA甲基化酶只有3种，而现有的去乙酰化酶抑制物选择性较差，因此第1代表观遗传药物有明显的细胞毒性，对各种细胞有广谱的杀伤力，它们抑癌效应更接近于化疗药物。但是针对甲基化调控酶及识别子所设计第2代表观遗传药物，作用靶标更为明确，对下游分子的作用机制更为特异，因此很可能表现出更好的靶向性，也被靶向性治疗界寄予厚望。此外，有研究发现，表观遗传药物和其他类别的药物联合使用可能会提高肿瘤细胞对药物的敏感性，降低抗药性。近10年来，越来越多的表观遗传药物进入临床试验，有些已经获批成药。相信随着肿瘤表观遗传机制的进一步明确，会有更多的表观遗传药物被开发并投入应用。