Ⅰ相代谢酶与药物相互作用

15.2.2.1Ⅰ相代谢酶生物学特性与临床意义

药物代谢酶即药酶，也称肝微粒体混合功能氧化酶，主要存在于肝细胞平滑肌内质网内，由血红素蛋白(P450)、黄素蛋白(NADPH－细胞色素C还原酶)及磷脂三部分组成，分子量约为45～55 kDa。P450酶系由Klingberg和Gorfinkle在1958年发现的，由于它在还原状态下可以与CO结合，并在波长为450 nm处产生最大吸收峰，因此而得名。近60年来药物代谢酶的研究取得了很大的进展，细胞色素P450及其同功酶在药物代谢、毒理学、肿瘤生化、药物相互作用研究中有着极为广泛的应用。

细胞色素P450(CYP)是Ⅰ相代谢酶，可催化多种药物的氧化反应和还原代谢。是药物代谢酶介导的药物－药物相互作用的主要参与酶。根据药物对酶的作用结果，又可以分为酶抑制作用和酶诱导作用两种，一般来说，前者的临床意义要大于后者。

CYP是一超基因家庭，编码500多种酶蛋白，人体内CYP450酶主要存在于肝脏和小肠中，其中参与药物代谢的CYP包括CYP3A4、CYP2D6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP1A2、CYP2A6。

目前人体内的CYP3A占肝脏全部P450酶和小肠中P450酶的30%，有CYP3A3、CYP3A4，CYP3A5及CYP3A7共4种亚型。CYP3A有广泛的底物，其中CYP3A4是最主要的同工酶，主要分布在肝和小肠中。CYP3A4的底物较多，且十分复杂。据统计大约38个类别共150多种药物是CYP3A4的底物。研究CYP3A4活性常采用的探针药物包括硝苯地平、氢化可的松、红霉素、咪达唑仑及右美沙芬等。利用HPLC或HPLC－MS/MS法测定尿中6β－氢化可的松/可的松的比率，可以定量研究CYP3A4的活性;也可以通过咪达唑仑羟化法和红霉素呼吸实验来评价CYP3A4的活性。目前公认的CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7的底物常见的有克拉霉素、红霉素、奎尼丁、阿普唑仑、地西泮、咪达唑仑、三唑仑、环孢素、他克莫司、茚地那韦、阿司咪唑、阿托伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氢化可的松、非那雄胺、芬太尼、美沙酮、利多卡因、那格列奈、普萘洛尔、特非那定、长春新碱、利培酮、伊立替康、硝苯地平、西沙必利、维拉帕米右美沙芬等，CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7的强抑制剂常见的有茚地那韦、那非那韦、利托那韦、克拉霉素、伊曲康唑、酮康唑、萘法唑酮、泰利霉素等;CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7的诱导剂常见的有奥卡西平、苯巴比妥、苯妥因、吡格列酮、卡马西平、利福喷汀、利福平、奈韦拉平、曲格列酮、糖皮质激素等。

CYP2D由CYP2D6、CYP2D7P和CYP2D8P共同构成，其中CYP2D7P和CYP2D8P是假基因，只有CYP2D6可以在肝脏和其他组织(如肠、肾和人脑)中表达，CYP2D6具有遗传多态性的特征，能代谢多种临床用药且有较大的个体差异性。根据人肝微粒体酶中CYP2D6含量的多少，可以将人类分为快代谢型(EM)和慢代谢型(PM)人群，前者含CYP2D6量多而后者含CYP2D6少。CYP2D6由497个氨基酸组成，可以催化异喹胍、右美沙芬、普萘洛尔、司巴丁、美托洛尔和可待因等30多种药物的代谢。CYP2D6临床常见的底物卡维地洛、氯丙嗪、噻吗洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、普罗帕酮、恩卡尼、氟卡尼、利多卡因、美西律、阿立哌唑、阿托西汀、度洛西汀、氟西汀、文法拉辛、昂丹司琼、甲氧氯普胺、非那西丁、米帕明、氟哌啶醇、利培酮、硫利达嗪、羟考酮、曲马多、可待因、右美沙芬、异丙嗪等;CYP2D6常见的强抑制剂有氟西汀、帕罗西汀、奎尼丁等;CYP2D6常见的诱导剂有地塞米松和利福平等。

CYP2C9亦具有遗传多态性，大量研究表明CYP2C9在人类存在几种等位基因突变体，其中最主要的有3种，即野生型(CYP2C9*1)、R144C突变体(CYP2C9*2)和I359L突变体(CYP2C9*3)，并已在不同的种族得到证实。许多物质均可以作为CYP2C9的底物，如:甲苯磺丁脲、华法林、苯妥英、非甾体类抗炎药、噻吩利尿酸、磺胺类抗菌药磺胺甲基异恶唑、镇静催眠药如环己烯苯、巴比妥;拟精神病药四氢大麻酚;抗肿瘤药环磷酰胺;性激素孕酮睾丸酮;前致癌物多环芳香族碳氢化合物;致突变剂杂环胺类;非肽类血管紧张素II受体AT1的拮抗药洛沙坦，新型HIV－1蛋白酶抑制剂amprenavir等。上述药物经CYP2C9代谢后，有些活性减弱，如磺胺甲基异戊唑、S－华法林等，有些则活性增强，如抗肿瘤药环磷酰胺。其中甲苯磺丁脲是目前最常用的CYP2C9的探药之一，用于检测人体内的CYP2C9酶活性。由于CYP2C9基因的多态性，导致了苯妥英钠在临床上使用时产生的疗效不一，有的患者用到最大耐受剂量时仍不能控制发作，有的患者使用常规剂量就出现了严重的药物不良反应;洛沙坦是血管紧张素Ⅱ受体亚型拮抗剂，属于联苯四唑类化合物的衍生物，在肝脏中经CYP2C9和CYP3A4氧化代谢为具药理活性的EXP3174，它在人体中的代谢有很强的个体差异性，在CYP2C9*2/*2和CYP2C9*1/*3的个体中，洛沙坦代谢为EXP3174的转化率比在CYP2C9*1/*1的个体中时低2～3倍，在CYP2C9*3/*3的纯合子个体中比在CYP2C9*1/*1的个体中时低9倍。大量等位基因的存在是细胞色素P450引起药物氧化代谢个体差异和种族差异的生化基础。CYP2C9常见的抑制剂有氟康唑、胺碘酮、保泰松、丙磺舒、伏立康唑、舍曲林和异烟肼等;CYP2C9常见的诱导剂有卡马西平、强的松、利福平等。

CYP2C19主要存在于肝微粒体中，CYP2C19分子由490个氨基酸组成，具有分子多态性。分子机制研究发现CYP2C19除了野生型(wild type，WT)等位基因CYP2C19*1外，还存在CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*4、CYP2C19*5、CYP2C19*6、CYP2C19*7、CYP2C19*8等多种突变等位基因，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3为CYP2C19基因的主要突变体，其他几种在人类中较为罕见。CYP2C19的临床常见底物有兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、苯妥英、地西泮、阿米替林、卡利普多、西酞普兰、氯霉素、氯米帕明、丙咪嗪、吲哚美辛、普萘洛尔和华法林等，CYP2C19临床常见的酶抑制剂有奥卡西平、奥美拉唑、丙磺舒、氟西汀、兰索拉唑、雷贝拉唑、氯霉素、酮康唑、西咪替丁和吲哚美辛等，CYP2C19临床常见的诱导剂有卡马西平、强的松、利福平等。

CYP2C8基因与CYP2C9、CYP2C19基因一样具有遗传多态性，并且可能是引起药物个体化差异甚至毒副反应的主要原因。自2001年Dai发现CYP2C8的两个突变体CYP2C8*2和CYP2C8*3以来，已经发现了超过14种不同的CYP2C8突变体，各突变体的活性、发生频率不易存在明显的种族差异性。CYP2C8*2、CYP2C8*3和CYP2C8*4发生频率较高。CYP2C8*2突变发生在5号外显子上，主要发生在非洲人中，突变率约为15%～20%，欧亚人群中鲜有发生;CYP2C8*3突变发生在两个SNP的紧密连接上的3、5号外显子上，白种人发生频率高约13%～23%，亚洲人群鲜有发生;CYP2C8*4突变主要发生在5号外显子上，欧洲人群突变发生率约8%。通过研究发现，CYP2C8临床常见的底物有紫杉醇、托拉塞米、阿莫地喹、西立伐他汀、瑞格列奈、胺碘酮等;吉非贝奇、甲氧苄啶、孟鲁斯特、槲皮素、酮康唑、阿米替林、特非那定、三唑仑、依法韦仑、沙奎那韦、洛匹那韦和替拉那韦分别对CYP2C8酶有不同程度的抑制作用，FDA在《药物相互作用研究指南中》建议体外试验抑制剂首选孟鲁斯特和槲皮素，体内试验建议首选选用吉非贝齐。目前已知利福平、苯巴比妥、地塞米松和皮质醇为CYP2C8酶的诱导剂。

CYP2E1最早于1984年从兔肝微粒体中被分离纯化出来，其特征为能被乙醇诱导，并命名为P450 LM3a。人的CYP2E1主要分布在成人肝脏，并且富集于肝小叶中心区域。在某些肝外组织(如肺和肠)也有发现而在胚肝中未检测到。目前已经确定为CYP2E1的底物大部分为前致癌物和前毒物如恩氟烷、氟烷、异氟烷、苯胺、苯等，少部分为药物如对乙酰氨基酚、氯唑沙宗、茶碱等;CYP2E1临床常见的抑制剂有二乙基氨磺酸盐，4－甲基吡唑等;CYP2E1临床常见的诱导剂有乙醇、异烟肼、利福平等。

与其他CYP1A不同的是，控制CYP1A2基因表达的分子机制不完全清楚，肝内CYP1A2的表达可以通过芳烃受体依赖性机制来诱导，然而CYP1A2的肝内诱导也存在芳烃受体非依赖性机制。CYP1A2在肝组织中有特异性表达。CYP1A2临床常见的酶底物有阿米替林、氯氮平、氟哌啶醇、普萘洛尔、维拉帕米、美西律、咖啡因、昂丹司琼、对乙酰氨基酚、非那西丁、利鲁唑、茶碱、R－华法林等;CYP1A2临床常见的酶抑制剂有氟伏沙明、环丙沙星、西咪替丁、胺碘酮、呋拉茶碱、甲氧沙林和米贝地尔等;CYP1A2临床常见的酶诱导剂有β－萘黄酮、奥美拉唑、莫达非尼、萘夫西林、胰岛素等。

CYP2A6仅占人类肝CYP的2%，是一个香豆素7－羟化酶，具有基因多态性特征，到目前为止CYP2A6共有17种等位基因变异体，包括*1～*16和*1×2基因复制体，大部分在体内外试验中得到了确证，它们主要参与尼古丁、氟烷等的代谢。通过代谢使尼古丁含量降低，从而降低对烟草的依赖性。CYP2A6的化学抑制药可用于吸烟依赖者戒烟，CYP2A6临床常见的诱导剂有巴比妥类药物和地塞米松等。

15.2.2.2Ⅰ相代谢酶抑制、诱导与药物相互作用的评价体系

Ⅰ相代谢酶活性被抑制后游离药物在机体内的清除率(clearance，CL)就降低。这一现象将带来严重的药物相互作用后果，是药物相互作用研究中需要重点关注的环节。一般来说，药物代谢酶的抑制作用包括竞争性抑制(competitive inhibition)和非竞争性抑制(noncompetitive inhibition)。若发生竞争性抑制时由于抑制剂和酶底物竞争同一结合位点，因此可以通过增加底物浓度来达到最大反应速度，这是最常见的抑制作用类型，特征为底物的Km增加但Vm不变;若发生非竞争性抑制时由于抑制剂和底物分别作用于酶的不同部位，因此通过增加底物浓度并不能消除抑制作用，这类抑制作用不常见但很重要，特征为底物的Km不变但Vm降低。血浆药物清除率和底物暴露量(AUC)是评价酶抑制剂的重要参数。当主要底物的代谢途径被抑制时，暴露量能提高5倍及以上的底物成为探针底物。根据探针底物AUC的增大和CL的降低，可以将酶抑制剂分为强、中、弱3类，见表15－1。

表15－1　CYP抑制剂的分类

竞争性抑制具有等级效应特征，即抑制剂对底物的作用不是全或无的关系，而是一种等级效应，酶抑制程度与抑制剂的血药浓度或剂量有关。即抑制作用将随着剂量的增加而增强，在这种情况下，若抑制剂半衰期很长，那么该药停药后抑制作用仍将维持一段时间，所以，临床用药时应注意底物剂量的调整。如茶碱合用依诺沙星出现的恶心症状;合用奎尼丁时去氧丙咪嗪CL降低而半衰期延长;青霉素和丙磺舒合用时前者血药浓度增高;西司他丁与亚胺培南合用，后者尿中原型药物浓度提高而疗效增加。这些现象均是竞争性抑制作用的结果。

尽管Ⅰ相代谢酶在机体内诱导现象较少见，但是一些敏感酶的诱导还是能够引起严重的药物相互作用。多数酶被诱导的本质是酶蛋白合成的增加，包括mRNA翻译活性增加;mRNA稳定性增加导致翻译后降解减少;DNA转录增加。人体中除CYP2D6未发现诱导外，其他大部分Ⅰ相代谢酶均可以不同程度地发生诱导现象。其中核受体组成型雄烷受体(constitutive androstane receptor，CAR)、孕烷受体(pregnane X receptor，PXR)、过氧化物酶体增殖体激活受体(peroxisome proliferators－activated receptor，PPAR)等分别在CYP2、CYP3等同工酶的诱导中发挥作用。

近些年来，科学家们一直致力于药物相互作用研究评价。在早期药物研发阶段，由于要评价各种化合物对CYP酶代谢的影响，工作量大，亟需建立高通量的筛选模型来进行研究。鸡尾酒法(cocktail)应运而生。该法采用各种酶探针底物同时加入到Ⅰ相代谢反应体系中与受试化合物一起孵育，用HPLC或HPLC－MSMS分析各底物的浓度变化，间接计算受试化合物对特定CYP酶活性的抑制作用。如常见的鸡尾酒方法有采用咖啡因、氯唑沙宗、氨苯砜、异喹胍和美芬妥英同时测定CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C19等的活性;咖啡因、奥美拉唑、右美沙芬、咪达唑仑同时测定CYP1A2、CYP3A、CYP2D6、CYP2C19等活性;咖啡因、氯唑沙宗、美芬妥英、美托洛尔和咪达唑仑同时测定CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C19和CYP3A4的活性。

在新药研发中，由于研究经费、对药物安全性的关注及法规的要求大大限制了任何具有显著药物－药物相互作用(Drug－Drug Interaction，DDI)的风险新化学实体的研究。因此体外CYP代谢的表型数据的获得至关重要，它可以对体内DDI的研究进行优先排序，见表15－2所示。

表15－2　体外CYP表型对临床DDI研究的判别

fm，CYP是指每个CYP亚型相对于总CYP酶代谢的分数。