胰蛋白酶酶活与比活的测定方法

一、目的要求

了解胰蛋白酶酶活的测定方法和原理。

二、实验原理

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所组成的肽键具有专一性。特别表现在对碱性氨基酸羧基一侧的选择。通常利用这样一类人工合成的物质为底物，研究其专一催化活性。因此，本实验采用人工合成的BAEE（N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯）为底物，进行酶反应来测定胰蛋白酶的活性。水解反应式如下：

在253 nm下，BAEE的紫外吸收值远远小于BA（N-苯甲酰-L-精氨酸）的紫外吸收值。BAEE 在酶的催化下，随着酯键的水解，BA 逐渐增多，于是反应体系的紫外吸收值也随之相应增加。胰蛋白酶的BAEE单位定义为：引起每分钟光吸收值增加0.003的酶量，规定为一个BAEE单位。

三、仪器与试剂

1．仪器

精密天平、电子台秤、紫外—可见分光光度计、恒温水浴锅、p H酸度计、秒表、移液吸管（或可调式移液管）、烧杯、容量瓶和量筒等。

2．试剂

N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐、Na2HPO4、KH2PO4等。

四、实验操作与步骤

1．胰蛋白酶酶活的测定

（1）p H7.6的0.067 mol/L磷酸盐缓冲液配制。取0.067 mol/L磷酸二氢钾溶液13 m L与0.067 mol/L磷酸氢二钠溶液87 m L混合，测p H值为7.6。

（2）底物溶液配制。在精密电子天平上称取 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐 12 mg，加水10 m L溶解，用p H7.6的0.067 mol/L磷酸盐缓冲液稀释成100 m L。制成后应在2 h之内使用。

（3）酶活测定方法。将被测酶液用p H7.6的0.067 mol/L磷酸盐缓冲液适当稀释，精确吸取0.2 m L于比色皿（1 m L）中，再加入3.0 m L底物溶液（底物溶液恒温于25℃±0.5℃），使比色池内的温度保持在25℃±0.5℃，立即摇匀，同时用秒表计时，并立即放入比色计的槽中，在253 nm波长处，30 s时第一次读取光吸收数值，以后每隔30 s读一次，至3 min。空白对照为底物溶液（BAEE）。

以吸光度值（A）为纵坐标，时间为横坐标作图，每30 s吸光度值的改变应呈线性关系（恒定在0.015～0.018 之间），若不符合上述要求，应调整被测酶液的浓度，再作测定。在上述吸光度值对时间的关系图中，取呈线性的吸光度值，酶活按下式计算：

式中 C——每1 m L供试品中含胰蛋白酶的单位数（U/m L）；

A1——直线上终止的吸光度值；

A2——直线上开始的吸光度值；

t——A1至A2读数的时间（min）；

0.003——吸光度值每分钟改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位；

V——比色皿中酶液加入的体积；

N——酶液稀释倍数。

2．胰蛋白酶比活的测定

（1）用考马斯亮蓝比色法测定原酶液和反萃液中总蛋白的含量（mg/m L）。

（2）根据原酶液和反萃液的酶活按公式计算比活。

五、实验说明

（1）将酶活比色测定时每隔30 s读取的各原始数据列成表格，并按公式计算酶活（U/m L），观察酶活的变化情况，分析实验误差。

（2）注意原酶液和反萃液中胰蛋白酶的比活的变化，要求迅速进行反萃取。

六、思考题

1．简述蛋白酶酶活的测定原理。

2．测定蛋白质含量的方法有哪些？并简要说明。