天然高分子材料

设计和选择生物材料是组织工程支架的关键步骤。在组织工程中，基质被用来支持细胞、促进细胞向形成新组织的方向增生和分化。天然聚合物由于与细胞外基质近似，可避免合成聚合物的慢性炎症刺激、免疫反应和毒性。活器官合成的天然聚合物按化学结构分为蛋白、多糖、天然聚酯。随着生物技术进步，天然聚合物可通过微生物发酵或体外酶处理获得。然而，植物、动物、海藻仍是天然聚合物最大的来源，是自然形成的维持内环境稳定和指导组织发育的最优化环境。模拟ECM来引导组织修复和组织工程的形态发生已做了很多努力。分离纯化ECM的主要组分，修饰或不修饰直接使用，是组织工程支架选择的策略之一。因为ECM在细胞活动中起着重要作用，这一策略假定这些生物分子能维持生物学信息和其他物理化学特征，接种细胞后能促进新组织发育，有助于克服合成材料缺乏细胞识别信号的缺陷。

一、胶 原

胶原蛋白（也称胶原）是哺乳动物结缔组织中最重要的结构蛋白，是ECM的主要成分，约占胶原纤维固体物的85%，体内蛋白质总量的25%～30%，相当于体重的6%。广泛存在于动物的皮肤、骨骼、肌腱、韧带、神经、血管、肠、胃、牙齿等组织中，起着支撑器官、保护机体的作用。胶原属于硬蛋白，其种类超过20种。其中Ⅰ型胶原具有优越的机械强度和生物相容性，非常适合用于皮肤替换和烧伤治疗。

（一）胶原的优、缺点

胶原具有以下优点：①生物相容性好，能促进细胞的黏附、生长和形成新的胶原纤维；②低免疫原性，经处理后可基本消除抗原性；③生物安全性高，胶原本身及其降解产物不良反应较少；④有生理活性和凝血作用；⑤易生物降解，在体内一定时间内分解成易于吸收的小分子和短肽；⑥力学性能、透水汽性能优良，在一定程度上能够满足机体对机械强度的要求，对伤口保护好，可减少换药或不换药；⑦具有较好的可溶解性，而且经纯化的可溶性胶原能够在体外再次形成与天然胶原纤维相似的有序纤维状结构，即具有重聚性，在组织工程应用中这一特点很重要；⑧官能团多，容易改性；⑨与其他生物活性组分在一起使用，具有协同效应，易使细胞在胶原材料表面增殖生长；⑩来源广泛。因此，胶原被广泛用于生物可降解缝线、人造皮肤、伤口敷料、人造腱及血管等方面。

但是，胶原蛋白作为生物材料，也存在以下不足：①力学强度不大，不能完全满足作为体内组织器官的力学环境要求；②胶原蛋白易于发生胶化反应，不利于胶原材料发挥它在体内的生物功能；③溶解后的胶原蛋白，不易固定；④生物降解速率快，不易控制。不过，在医用材料领域，胶原蛋白还是现今优先采用的生物高分子材料。

（二）胶原蛋白的分子结构和生物学性能

胶原由3条多肽链组成，不同类型的胶原结构差别明显，但都共有一个特征性的结构，即由3条肽链组成的α右手三螺旋结构。在Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型、Ⅷ型、Ⅹ型胶原中是由3条相同的链形成，在Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅸ型和Ⅺ型胶原中由另外1条、2条或更多的不同链构成。3条α链的每一条内部形成一个被扩展的左手螺旋，每螺旋一次的螺距含有18个氨基酸。3条链是围绕一个中轴以右手螺旋的方式超螺旋而形成三螺旋结构。三螺旋结构形成的前提是含有一个甘氨酸残基，位于每个多肽链的第三个位置，构成Gly－X－Y的重复结构，为胶原的共同特征，X、Y表示任意氨基酸，X通常是脯氨酸（Pro），Y通常指羟脯氨酸（Hyp）（图4－1）。胶原蛋白中含有大量的甘氨酸（占31．4%～33．8%）、脯氨酸（占11．7%～13．8%）、羟脯氨酸（9．4%～12．5%）和丙氨酸，由于羟脯氨酸比较均一，通过测量羟脯氨酸含量，易于计算出胶原含量，但胶原中缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸，酪氨酸含量也很低。许多哺乳动物与人胶原蛋白的三螺旋结构区域基本一致，因此，异种来源的胶原蛋白的同源性很好。

图4－1　胶原结构

胶原蛋白是一种纤维蛋白，其基本组成单元是原胶原分子。原胶原蛋白分子结构由N－末端区域、螺旋区域和C－末端区域组成，借助于原胶原蛋白氨基蛋白酶和羧基蛋白酶分别将原胶原的N－末端和C－末端区域断裂而形成胶原蛋白。原胶原分子定向整齐排列，分子之间通过共价键互相交联，彼此并排，形成稳定的胶原微纤维（图4－2）。由结构分析发现，原胶原分子由3个自身按左螺旋排列的多肽键构成，其中2个肽键是一样的，第三个稍有不同。

原胶原分子这种特殊的结构使得该分子又长又细，长达300nm，甚至更长，直径仅15nm，分子量约为30万，且具有刚性，生成的产物具有较高的机械强度。但胶原蛋白又不算是一种典型的纤维，易引起小纤维有规则的扭结。当它被拉长时，扭结伸直，其纤维状结构受热被破坏，当温度超过42℃时，胶原纤维的结构会发生变化。当温度超过65℃胶原纤维被破坏，长度缩短到原来的1／3，并成为无定形胶原聚合物，有类似于橡胶的性质。

（三）胶原的提取方法

胶原可以从皮肤、肌腱、骨、软骨、胎盘、肺等组织中提取，根据不同的组织和胶原蛋白类型，提取的方法也有所不同。胶原的水溶性差，另外，由于非胶原成分和胶原的纤维化影响，尤其是胶原分子间的共价键交联增加了溶解的难度。目前，提取胶原的技术方法较成熟，一般有两种手段，一是用溶剂的化学法，二是用酶的生物化学法。化学法中根据溶剂的不同，可分为中性盐法和酸性法，两者可以联合应用，交互提取，增加胶原的可溶性。化学法也可与酶法结合，能很好地提高提取产率。

作为溶剂使用的酸主要有醋酸、枸橼酸、盐酸等，其中醋酸最为常用，主要是破坏分子间氢键而引起纤维膨胀、溶解，但其溶解量很少，和酶法相比提取产率比较低。酸法对胶原的损伤严重，难以获得高品质的产品。用酸法提取的胶原最大限度地保持了其三股螺旋结构，适宜用作医用生物材料及原料。

图4－2　胶原超分子结构的分级构成

碱溶法操作简便，但由于水解比较严重，得到的是相对分子质量较小的胶原产物，还会产生DL－氨基酸消旋混合物，即旋光性化合物。由于只有L－氨基酸才可作为高等动物的有效氨基酸源，D－氨基酸不能作为有效氨基酸源，其中D－氨基酸若高过L－氨基酸，则会抑制L－氨基酸的吸收，且有些D－氨基酸是有毒的，有的甚至有致癌、致畸和致突变作用，不适合用于生物医用材料的胶原蛋白的提取，因此本法一般只辅助酸溶法来提取胶原。

氧化法也辅助用于生物医用材料在胶原的提取中，用H2O2等氧化剂对铬革屑进行处理，使铬革屑脱鞣，再经过漂洗、过滤，将胶原和铬分离。氧化法脱铬速度快、效果好，对胶原的结构破坏程度小，获得的胶原产物分子量相对较大，很难被皮肤吸收。

对胶原有消化作用的蛋白酶较多，有植物蛋白酶（如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶等）、动物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、微生物蛋白酶。此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶Flavourzyme、Alcalase等。目前，应用于实际生产中的酶主要有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等。为了获得较高的经济价值，在选取酶的时候，一般要考虑酶对胶原作用的强弱及酶的价格。如果酶对胶原的作用太弱，就无法得到高的胶原溶解率，而酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差上千倍，甚至更大。因此，开发的新产品如无特殊要求，一般选用已完全工业化的酶，在实际使用过程中再对选用的酶初步纯化，除去其中的物理杂质，同时这也可以改善酶及水解产品的色泽。此外，还须考虑酶对胶原的作用位点，因为这会直接影响最后水解产物分子量的分布，对水解产物是否适合开发所需的产品起着至关重要的作用。

酶处理法具有速度快、条件温和、对蛋白质的成分破坏小等优点，而且水解所得到的胶原分子量相对较小，有利于皮肤的吸收。另外，还可以减少环境污染。选择适当的单一酶、复合酶及工艺条件，理论上可以得到所期望的对应分子量的水解胶原。为提高胶原蛋白在高附加值领域的应用，采用此法对胶原蛋白进行水解是近几年研究的热点。

联合提取胶原的方法有酸酶法、酶酶法、酸碱法和碱酶法等，以酸酶法联合应用最多见。

对用于提取胶原的组织材料进行前处理很重要，要刮掉非胶原性组织，如碎肉、脂肪，一旦有脂肪混入，后面的操作再去除较困难。然后，对提取组织进行切片、粉碎或匀浆，组织粉碎程度越细越好。选择适当的组织材料是有效提取各型胶原的前提条件，一般可用动物皮、肌腱和骨提取Ⅰ型胶原，从透明软骨中提取Ⅱ型胶原，Ⅲ型胶原从胎皮中提取，Ⅳ型胶原从富含基底膜的脏器组织，如肾小球、胎盘、眼球小晶体、角膜中提取。年龄是影响胶原交联程度的重要因素，因此，选择年龄小的动物，其组织提取胶原相对较容易。

从组织提取可溶性胶原，依所用可溶溶剂不同，大致可分为中性盐可溶性及酸性可溶性胶原，由于胶原对温度敏感，pH中性时的变性温度为40～41℃，酸性时为38～39℃，因此，所有操作最好在10～15℃下进行，中性盐溶剂一般采用0．15mol／L、0．45mol／L及1mol／L的NaCl溶液，酸性溶剂多采用pH 3．5的0．05～0．5mol／L醋酸或0．15mol／L枸橼酸缓冲液，而醋酸提取的胶原含多聚体成分较多。一般说来，经上述中性盐或酸性溶剂反复抽提2～3次后的残渣，即为不溶性胶原。

1．从肌腱中提取胶原 肌腱中主要含Ⅰ型胶原而其他类型的胶原含量很少，便于提纯制备单一类型的胶原，因此也是目前提取胶原最常用的方法。在肌腱中提取胶原主要从牛肌腱和鼠尾肌腱中提取。我们还成功地从人肌腱中提取出胶原。

鼠尾肌腱酸溶性程度高，采用醋酸提取，一般过程是取大白鼠鼠尾1根，泡于75%乙醇中1h，剪成2～3cm的小段，去皮，抽出肌腱，剪碎成泥，然后将腱泥浸泡于0．05mol／L醋酸溶液100ml中，4℃，48h，其间不时摇动，即可得到粗制胶原溶液，再用1mol／L NaOH中和，23 000g离心，重新溶于0．05 mol／L醋酸中即得到精制胶原。

牛腱中的Ⅰ型胶原是酸不溶性的，常规的无机盐提取法不易提取，一般要用酶法进行提取，温度、底物、缓冲液、pH、酶及其相应的辅酶或抑制剂将直接影响提取、纯化效果及三螺旋结构的破坏程度。基本过程是将100g牛肌腱去筋膜和肌肉并清洗干净后，氯仿／乙醇脱脂，切成薄片，然后用匀浆器磨碎，蒸馏水洗涤后，再悬浮于1．5L含胃蛋白酶120mg的0．05mol／L的枸橼酸中，在10℃中缓慢搅拌消化后72h，离心，取上清液用10mol／L NaOH调节至中性，加NaCl固体粉末至浓度2．5mol／L，搅拌过夜，盐析后离心，沉淀即为Ⅰ型胶原蛋白。

赵苍碧等建立于胃蛋白酶和无花果蛋白酶提取的方法，新鲜牛腱去除筋膜、脂肪及杂质后，冷冻至硬化，沿牛腱纤维方向切成1mm厚薄片，称重，0．1%Na2CO3溶液浸泡2h，蒸馏水洗5次，不锈钢筛网滤去水，晾干。取一定重量的肌腱放入三角烧瓶中，分别加入含不同酶质量配比的0．3%醋酸溶液（pH 2～3）适量，0～4℃下控温缓慢搅拌，3～5d，在高速冷冻离心机中以每分钟200转离心，上清液即为粗提胶原蛋白溶液。然后，加入1%H2O2，混匀后静置4h，用7%枸橼酸三钠溶液调节pH至5．0，滤掉沉淀，在剩余液体中加入NaCl，缓慢搅拌，4℃静置过夜保存，沉淀物用Tris缓冲液（pH7．0）4℃浸泡24h，再将沉淀物装入透析袋内，用1%、0．5%、0．1%醋酸透析1d，再用蒸馏水透析3d，每天换液2次，最后得到较纯的胶原液，冷冻保存。结果表明，胃蛋白酶（活性1∶3 000）与牛腱质量之比以1∶10最佳，提取速率最大。无花果蛋白酶以1∶100配比最好，提取率提高近1倍，时间缩短1／3，用量只有胃蛋白酶的1／10。

也有采用盐酸浸泡的方法，使产率达到80%以上，不需要高速离心、盐析、透析等步骤。具体步骤是取新屠宰的牛腱500g，常温下用2mol／L的盐酸浸泡48h，蒸馏水清洗，0．5mol／L NaOH中和，然后浸泡于0．1%胃蛋白酶溶液中，12h，20℃。取出用水清洗，获得无细胞胶原框架。将其切成0．05～0．5cm的小块，在与上述相同条件下复浸和酶解一次。在偏振光显微镜监控下将小块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原，在50～90℃下干燥至恒重。这样制备的胶原不但可以做软组织填充剂，也可以做硬组织填充剂。

2．从皮中提取胶原 皮胶原的提取工艺较为成熟，是提取胶原的常用方法之一。通常有酸法、碱法、酶法及酸酶结合法、碱酶结合法。皮组织的来源有牛皮、猪皮、鼠皮、兔皮及鱼皮等，其中牛皮最常用，提取出的主要为Ⅰ型胶原，提取工艺成熟且提取出来的胶原纯度比较高。

基本过程是将皮肤组织洗清，氯仿／乙醇（2∶1）脱脂，去除皮下组织，去毛、细切，干冰冻结粉碎，含20%NaCl的0．05mol／L Tris－HCl洗涤，沉淀用含0．45mol／L NaCl的0．05mol／L Tris－HCl缓冲液在4℃下搅拌1d，多次反复抽提，然后更换为1．0mol／L NaCl 0．05mol／L Tris HCl缓冲液进一步反复抽提。上清按每升加入30ml冰醋酸，使胶原溶解，再加NaCl达1．0mol／L进行盐析，搅拌过滤，离心45min，沉淀物用0．05mol／L醋酸反复抽提，以每分钟28 000转的速率离心60min，上清用5．0mol／L NaOH中和，加入NaCl至最终浓度为4．4mol／L搅拌过夜。中性条件下盐析，离心45min，将沉淀物用不同浓度NaCl由低到高逐级盐析使可分离出Ⅰ型、Ⅲ型胶原。

3．从骨和软骨中提取胶原 从骨和软骨组织中提取出的胶原主要为Ⅰ型和Ⅱ型。常用的组织有禽类软骨、人胚骨、猪的关节软骨和牛鼻软骨等，由于禽类的骨组织结合了胃组织和连接纤维蛋白组织，从禽类的骨中提取Ⅰ型胶原的工艺更容易生成粉末状的胶原。在软骨中提取胶原之前，先对软骨进行H2O2处理，然后再用胰蛋白酶进行消化处理有助于清除软骨中的黏多糖，能得到纤维状的软骨胶原蛋白。

透明软骨Ⅱ型胶原提取的基本方法是将牛关节透明软骨进行脱脂后用刀片削取软骨，蒸馏水洗涤，切细，取120g透明软骨悬浮于1LpH为7．5的0．15mol／L NaCl、0．05mol／L Tris－HCl缓冲液中，匀浆，每分钟5 000转，15min，沉淀再悬浮1L1．0mol／L NaCl、0．05mol／L Tris HCl缓冲液中再次匀浆，离心15min，重复2次，沉淀用1L含125mg胃蛋白酶和200mg NaN3的0．5mol／L的醋酸溶液中，室温搅拌消化1d，离心15min，上清加NaCl固体粉末至浓度为0．9mol／L进行盐析，搅拌过夜，离心，然后在0．5mol／L醋酸中反复抽提，以每分钟28 000转的速率离心60min，5mol／L NaOH中和，加NaCl固体粉末至浓度为4．0mol／L进行盐析，搅拌过夜，离心45min，再重新悬浮于1LpH为7．5的4．0mol／L NaCl、0．05mol／L Tris－HCl缓冲液中，搅拌过夜，离心，最后用500ml 2．4mol／L NaCl、0．05mol／L Tris－HCl缓冲液进行3次抽提，超速离心15min，上清液即为Ⅱ型胶原蛋白，沉淀为Ⅱ型胶原多聚体。

4．从结缔组织中提取胶原 在结缔组织中主要可以提取Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原。采用的材料主要为胎盘、巩膜、乳猪肝等组织。为了进一步降低胶原材料的抗原性，人们开始考虑用人的组织来提取胶原。人胎盘胶原不易引发受术者产生免疫反应，存留时间长，矫形效果优于牛胶原同类产品。人Ⅳ型胶原可应用在接触性镜片、眼内或角膜植入物中。

从人盘胎中提取Ⅳ型胶原的基本过程是，取健康正常分娩的胎盘清洗去污后，剪成小块匀浆，用0．05mol／L Tris－HCl（pH7．2）缓冲液和0．5mol／L醋酸分别抽提数次以去除杂蛋白，至组织呈乳白色，然后溶于0．5mol／L醋酸中，用胃蛋白酶消化，6℃，24h，不时搅拌，离心，上清液中逐渐加入NaCl固体粉末至终浓度为1．2mol／L，搅拌过夜，离心，沉淀溶解于0．1mol／L醋酸中，用0．05mol／L Tris－HCl（pH7．4）缓冲液和0．2mol／L NaCl透析过夜，离心，去沉淀，上清中加入NaCl固体粉末至终浓度2mol／L，即可得到Ⅳ型胶原粗品。再用0．05mol／L Tris－HCl（pH8．6）、2mol／L尿素和0．2mol／L NaCl溶解，并用相同缓冲液于4℃透析24h，经DEAE－52－纤维素柱色谱分离，收集蛋白峰，再用0．04mol／L醋酸钠（pH4．8）、2mol／L尿素透析，最后用CM－52纤维素柱色谱分离，须0～0．3mol／L NaCl溶液梯度淋洗，第一峰即为Ⅳ型胶原纯品，透析去盐，冷冻干燥，得到Ⅳ型胶原纯品于－20℃保存。

5．人工生物工程方法合成胶原 随着生物工程技术的发展，采用重组DNA技术，进行人体胶原的表达与纯化，是获得胶原产品的新方法，但目前还难以获得较大量的胶原生产。另一个制备人体胶原分子的重要途径是转基因动物。美国胶原公司利用特定乳腺表达系统，成功实现从转基因动物奶汁中提取人胶原，将特定乳腺表达系统微量注射到受精卵母细胞后，移植到哺育动物母体，使其怀胎足月，得到能产生含重组人胶原奶汁的哺乳动物。这种方式产生的人胶原是不含其他类型胶原杂质的单型胶原。此外，日本广岛大学自然科学研究所吉里胜利教授，在蚕体内成功合成了人体胶原蛋白，他把人的基因注入蚕卵，最后在蚕茧中抽出了含有胶原蛋白的丝纤维，其中胶原蛋白的含量约为1%，但如果将其应用于工业生产，则必须将丝纤维中胶原含量提高到5%～10%。

（四）胶原蛋白的交联

纯化的胶原可以制成许多不同形式的产品，如膜、薄片、海绵、珠体、管、带等，其中膜和海绵应用最多。一方面由于胶原蛋白再形成的材料（如膜和海绵）并不具有所要求的拉伸强度和耐蛋白水解能力，造成在组织构建、运输和移植过程中的操作困难，易被创面胶原酶降解，另一方面由于其移植后降解速度的不可控性，降解过快，造成移植后新生组织和器官形成的时间不够，难以真正达到重建组织器官功能的目的。因此，有必要对胶原进行进一步的改性，改性的方法有共混改性和交联改性，其中交联改性最为常用。

共混改性是引入其他一些材料，如氨基聚糖、壳多糖、羟基磷灰石等，可以有效地改善胶原的力学性能，延缓胶原酶的降解，增加新的性能。我们研制的复方壳多糖真皮基质在这三点上的改善作用非常明显，但是由于共混材料的多相、多组分，后处理较困难。

交联改性是通过某些交联方法，在胶原蛋白分子内和分子间引入共价键的交联，它能够保留大部分胶原蛋白结构，提高胶原纤维的力学性能和化学稳定性，控制降解速度，因此胶原蛋白的优势依然保留，而交联剂用量少、成本低、方法简便，有明显优势。交联改性的方法主要有物理方法和化学方法。

物理方法有脱氢加热、紫外线和γ射线照射、光敏剂氧化交联等方法，虽然没有交联剂带来的细胞毒性问题，但由于交联程度低且不均匀，力学强度差，因而交联效果不明显。

化学交联有三价金属离子、醛（甲醛、戊二醛、双醛、糖）、碳化二亚胺、酰叠氮、聚二醇等方法。其中，戊二醛法最为常用。近来研发最多的是碳化二亚胺法，3－二甲基氨丙基碳化二亚胺（EDC）使用最普遍。戊二醛的2个醛基可分别与2个相同或不相同分子的伯氨基形成Schift碱，将2个分子以五碳桥方式连接起来，高浓度戊二醛与胶原肽链的赖氨酸或羟氨酸残基的ε－氨基反应，形成分子间的交联，胶原3 156个残基中约85个氨基酸残基被交联，低浓度时与胶原肽链形成分子间交联，因此建议用低浓度较好。戊二醛对胶原的交联是不可逆的，对沸水、酸、酶的抵抗能力突出，对脲、氨基脲处理稳定，交联的pH范围较广泛，pH 5～12，均表现出良好的交联性能，以pH7～8最好，但是戊二醛交联，可能对细胞有毒，须彻底清除未交联的戊二醛。碳化二亚胺交联胶原时，常是先与肽链的羧基反应生成中间产物，再与肽链的氨基反应而形成偶联物，交联的pH范围为5～9，与胶原交联的最佳条件是pH7．0左右，4℃或室温24h，碳化二亚胺交联胶原，抗胶原酶的降解能力比戊二醛关联的胶原差一些，且有潜在的钙化能力。

（五）胶原应用形式

胶原及其改性产物是一类常用的医用高分子材料，已大量用于生物敷料的生产，因为胶原蛋白可大量分离、纯化，通过不同的制备方法调整其通透性，降低其免疫原性，主要可制成薄膜型、海绵型和凝胶型敷料。这类敷料拉伸强度高，但延展性低，易干裂；具有较好的透水通气性；经过交联或酶处理降低其抗原性；可以添加药物、抗生素、透明质酸、肝素、FGF、PDGF、EGF等成分，进一步提高其性能。如胶原与壳多糖制成复合生物敷料性能得到明显的提高，膜的机械强度好，柔软性好，有弹性，与皮肤也有良好的贴附性，又有抑制细菌生长的作用，是一类有发展前景的敷料。

1．胶原类生物敷料 主要有胶原膜、胶原海绵膜、胶原凝胶等。

（1）胶原膜：移植于创面后无明显炎症反应，宿主细胞能很快的浸润生长，可起到防止细菌污染伤口的屏障作用，胶原膜吸水性好，还可减轻创面的组织水肿程度，与创面的贴附性好，有利于药物释放和促进创面坏死组织的溶脱，减轻炎症反应，促进胶原合成，加速上皮化过程。但由于膜太薄，操作较困难，更主要的是缺乏足够的空隙度和表面积接触，伤口的渗出液易在膜下积聚成液腔，造成患者疼痛和不舒服感，因此使用上受到限制。

（2）胶原海绵膜：胶原海绵在早期是以封闭伤口、减少感染、阻止体液丧失为主要目的，但在临床应用中发现有许多不足，发展到改性胶原敷料，降低其免疫原性，可添加其他成分，如透明质酸、壳多糖、肝素、葡胺聚糖、抗生素、bFGF、PDGF和EGF，从而赋予更多的生物学作用，达到更好地促进伤口愈合的目的。

胶原止血海绵制备过程为将牛腱粉碎后加入醋酸溶解5d，过滤除去不溶物，然后上清中加入饱和NaCl溶液，使胶原沉淀，再用蒸馏水洗涤，置溶于0．1%醋酸中，配制15～25mg／ml溶液，离心取含50～60g胶原的上清液，加6～8ml甲醛，在35～41℃下搅拌至发泡，控制泡沫细小而均匀，经过浇模、冷冻、干燥、脱模即可得到多孔松软的成品，切成不同规格，于120℃的干风下消毒2h，密封包装，即为胶原止血海绵。

胶原海绵有以下4个方面的作用：①可大量吸收组织渗出物，防止湿伤口干结而起到滑润作用；②防止伤口受到机械伤害和细菌感染；③可作为药物递送载体，适合于抗生素短期给药（3～7d），该系统无副作用，且胶原几天后可自动被吸收；④胶原为表皮细胞的迁移和增殖提供了支架和营养交换的空间，有利于上皮细胞的增生修复，从而能促进创面的愈合。其中，胶原海绵的多孔性是非常重要的，一般认为，孔隙率应大于90%，孔径大小在200～300μm较适宜。研究发现，孔径大于80μm时对新生纤维细胞在其中的生长和毛细血管的形成是必要的。国外应用较多的胶原海绵是Integra，它是用牛胶原和硫酸软骨素通过戊二醛交联制成的海绵，表面覆盖有一层硅橡胶，厚2mm，有70～200μm的微孔。

（3）胶原凝胶：由于胶原具有很好的复凝特性，可以制成天然高分子凝胶，但材料稳定性差，易降解，现多与其他天然高分子或合成高分子材料制成共混水凝胶。如胶原－壳多糖、胶原－聚乳酸、胶原－聚氨酯、胶原－聚甲基丙烯酸羟酸、胶原－聚乙烯醇等水凝胶。由于水凝胶与人体组织的结构和性质极为相似，因而其生物学价值很重要，尤其是在再生医学领域有很大的发展潜力。

胶原凝胶类敷料可以与不平整的伤口形成紧密的结合，消除了死腔，减少了细菌得以生长的机会，且潮湿的环境有利于修复细胞的生长，但抗胶原酶降解能力差且收缩严重，因此很少单独使用，但其生物学性能优于传统胶原海绵真皮。

综上所述，单纯的胶原膜、胶原海绵和胶原凝胶只能作为暂时性生物敷料，尽管是由外源性胶原制备，但仍然可以促进创面的凝血，诱导与创面愈合相关的细胞迁移、增殖，具备良好的透气性、透水性，在一定程度上保护创面防止感染和促进创面的愈合。但因其仅有支架没有细胞的参与，难以实现完美的伤口修复作用，人们一直希望能有一种永久性替代自体皮肤移植的材料，以避免因供皮给患者造成新的损伤，也是解决大面积深度烧伤患者自体皮源不足的根本手段。因此，人们又利用胶原作为基质，研制出一系列的组织工程皮肤替代物。

2．基于胶原的组织工程皮肤替代物由于胶原具有良好的生物学性能，已被广泛应用于医学和生物学领域，尤其是它具有凝聚特性，可与其他材料复合制备出性能更好的复合材料，因此特别适合组织工程领域支架材料的构建。胶原应用的形式有膜、带、薄片、海绵、珠体等，在皮肤组织工程中，最常见的应用形式是海绵、水凝胶和膜三种形式。

胶原支架材料从制作方法上大致可分为两种类型。一种是将可溶性胶原利用其重聚性特点，再制成重组的胶原生物材料，另一种是利用胶原蛋白组织的天然结构，制备脱细胞真皮基质，这种材料更适于用作支架材料。从组分上来看，有单纯胶原支架、复合胶原支架，胶原常与透明质酸、硫酸软骨素和壳多糖联合应用。复合组分中的成分往往是天然细胞外基质，对细胞的黏附、迁移、增生和生长分化有利，胶原和硫酸软骨素支架的优点，一是胶原经硫酸软骨素交联后，能够降低胶原的生物降解速度；二是提高物理特性，如弹性模数和拉伸强度；三是增大孔隙结构，改善透气性和渗湿性。胶原和透明质酸复合，其优点是能够进一步提高细胞的迁移，促进伤口愈合，且有良好的黏弹性和机械特性。胶原经壳多糖交联后的优点是改善了物理特性，降低了胶原的生物降解速度，并具有抑菌功能等。

（1）胶原膜支架：胶原膜通常是经纯化后的胶原溶液冻干后，经风干或是用浓氨溶液熏30min，在37℃恒温箱中干燥成膜，成膜后可以用紫外线照射或是0．06%戊乙醛交联，由于胶原膜是表皮细胞迁移、黏附、生长、增殖的重要支架，有利于伤口的再上皮化，因此也常用作KC培养的底物。以胶原膜作为支架，可用于制备表皮替代物，作为培养角质形成细胞膜片的支撑和促进生长基质。Horch等将人角质形成细胞培养在未交联的Ⅰ型胶原膜上，无血清条件下培养，移植到裸鼠创面，可诱导多层鳞状上皮细胞重建。王韦等用猪皮胶原涂在F46膜上，干燥成膜，接种表皮细胞，培养成膜片，再进行自体移植，表皮膜片贴向创面，移植后4d，表皮细胞膜片使已黏附于创面，形成新的表皮层，表明胶原膜可促进表皮细胞生长和连片。陈晓东等观察了胶原膜对Fb生长的影响，将培养7d的Fb黏附于胶原膜上，14d时细胞突起形成并锚定于膜上，17d时分泌的IL－6高于二维培养的Fb。

由于胶原膜片脆性大，搬运操作较困难，因此实际使用较少。

（2）胶原海绵支架：这是较常用的一类支架，是胶原或胶原与其他细胞外基质通过戊二醛等方法交联后制备的胶原海绵，然后将Fb种植在海绵内，表面再接种表皮细胞，形成双层结构的皮肤替代物。由于海绵的孔隙较大，造成接种的表皮细胞易陷落到海绵内，难以在海绵表面形成表皮层，因此用海绵构建的多为真皮替代物。对种植Fb时也有影响，Fb不一定能全部黏附到海绵内，即细胞上架率难以达到100%，造成细胞丢失。马刚等采用冷冻干燥和戊二醛交联，制成上面粗糙，底面成膜的胶原蛋白基质网架，按2× 105／cm2密度接种Fb；1h后只有少量细胞散在分布于海绵的网孔内。第三军医大学王旭等制备的夹心式双层皮肤替代物是在胶原海绵膜的两面分别接种KC和Fb。

胶原还与硫酸软骨素等糖胺聚糖、壳多糖组合制成海绵类支架在皮肤组织工程学中有所使用。如Integra，是胶原与鲨鱼硫酸软骨素经戊二醛交联制成的胶原海绵类真皮替代物；胶原－壳多糖－GAGs支架也在皮肤组织工程中应用。

（3）水凝胶支架：由于水凝胶制作技术简单，更为重要的是在制作过程中能够与Fb充分混合，能够完美地模拟其在体生长情况的三维空间，有利于Fb的生长和增殖，凝胶内充分水化，也有利于细胞的营养代谢。因而是目前构建组织工程真皮的重要技术方法。此外，凝胶的表面没有孔隙，利于接种表皮细胞，而不至于陷落到凝胶内。研究表明仅有极少数表皮细胞陷落到凝胶的表层下面。因此，也是制作组织工程双层皮肤的重要方法。本方法由EB Bell博士最先创立，并形成了第一个以天然细胞外基质为支架材料的组织工程皮肤产品——Apigraf。国内也有类似产品得到批准。

胶原水凝胶支架由于物理特性差，扩张强度低，凝胶收缩巨大，抵抗创面胶原酶降解的能力低，不具有抗感染作用。我们针对这些缺陷，通过对支架材料进行改进，研制的复方壳多糖组织工程皮肤具有表皮分化层次清楚，真表皮间结合较紧密，物理特性好，可任意剪切缝合，抗张强度较强，增强了抵抗创面胶原酶降解能力和主动抑菌能力等特性，是一种有前途的新型凝胶类组织工程皮肤。

与其他材料组合，如胶原微海绵植入合成聚合物支架，也可增强其力学性能。胶原凝胶包被合成材料组成的复合支架也在组织工程皮肤中有应用，细胞黏附、生长和分化、修复效果明显优于单纯的合成支架。胶原海绵和凝胶可以携带生长因子和其他活性物质，控制释放，增强组织工程方法的治疗效果。

（六）胶原的生物降解

胶原合成和胶原降解是生理重建的正常现象。胶原材料移植于创面后会发生降解，其降解的速度取决于胶原材料本身的免疫原性、宿主的反应性、胶原移植物对细胞浸润的适应性和对蛋白水解酶作用的敏感性，并受到细胞与基质相互作用的调节，包括酶的产生、激活和抑制，胶原蛋白的降解不同于一般蛋白类，半衰期从数周到数年不等，未变性胶原具有典型的螺旋结构，能够抵抗一般蛋白水解酶的消化，不易解聚，须有一定浓度的胶原酶和特定条件才能降解，因此胶原蛋白的降解常以胶原酶活性来表示（图4－3）。

图4－3　原胶原的分解

胶原基皮肤替代物覆盖于创面后发生降解存在以下几条途径：①补体和血小板因子激活介导炎性细胞浸润。②胶原诱导产生的趋化因子，如PDGF和纤维粘连蛋白，可先后趋化Fb和平滑肌细胞，且胶原本身对Fb也有趋化性，Fb移入胶原移植物内，于3～5d后发生血管生成和快速的胶原分解与合成。③白细胞和巨噬细胞吞噬降解的多肽。蛋白酶降解胶原的影响因素较多，主要与胶原本身分子量大小、种类、免疫原性强弱、耐蛋白酶能力和分子间交联程度有关。酶降解一般是先在胶原分子螺旋部分的特定部位裂解出3个酶链，形成凝胶多肽，在细胞外再被中性蛋白酶进一步水解，被白细胞或巨噬细胞吞噬，由细胞内溶酶体酶降解。④被创面细菌分泌的胶原酶直接降解。

降解胶原的肽链内切酶主要分为4类：①金属蛋白酶；②丝氨酸蛋白酶；③半胱氨酸蛋白酶；④天冬氨酸蛋白酶。金属酶和丝氨酸蛋白酶在生理pH条件下降解作用最佳，而半胱氨酸蛋白酶（组织蛋白酶B、H、L、S）和天冬氨酸蛋白酶（组织蛋白酶D）则在酸性的环境中作用最佳，但仍以吞噬胶原片段的细胞内溶酶体发挥作用为主。随着环境改变，蛋白酶可协同消化胶原，但重吸收中，细胞内消化不占主导地位。化学交联胶原移植物对酶的消化相对稳定，降解慢，且降解速度与交联的程度和性质有关。

胶原酶普遍存在于脊椎动物的细胞内及分泌物中，通常以活性的形式存在，经纤溶酶及激肽释放酶等作用后变为有活性的胶原酶，但是胶原酶来源不同，对不同类型胶原水解的能力也不同，人皮肤胶原酶只对Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原起作用，对Ⅳ型、Ⅴ型胶原无效。人中性粒细胞的胶原酶降解Ⅰ型胶原的能力强，为降解Ⅲ型胶原的15倍。细菌胶原酶也只降解Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原，对Ⅳ型胶原无效，机制上也不同于动物胶原酶，它可以从两端多点降解胶原。

胶原基组织工程皮肤形成过程中，细胞合成细胞外基质的能力是其生命活力的重要指标。Fb合成的前胶原，分泌到细胞外后，经内切肽酶水解生成原胶原，自行聚合成胶原微纤维，不够稳定，经过共价交联形成稳定结构。培养2周后组织工程皮肤的胶原蛋白基质网架在电镜下已见到成束的胶原纤维。培养3周的胶原蛋白基质网架，在偏振光显微镜下可见到有成束的红色双折光物质和细的绿色双折光物质。单纯基质网架只见到红色双折光物质，这一结果提示当组织工程皮肤培养过程中，又有新的胶原由组织工程皮肤所分泌。因此，胶原支架在种植种子细胞后不断地处于原有胶原被降解，新胶原又有合成的动态过程，即处于不断的重建过程中，以进一步完善胶原的三维结构。

总之，胶原由于其良好的生物相容性、低免疫性、完全可降解性和天然拉伸性等特性，已成为组织工程皮肤的最重要的支架材料，其优点表现为：①黏附性好，利于细胞的生长、基底沉积、血管再生和上皮移行及再生长皮化；②具有最适宜的孔径，特别适合细胞的营养交换、生长因子扩散和血管长入，保持了天然的渗透性；③易于其他支架材料共用，利于开发出更好的支架材料，可以任意塑形，应用形式多样，利于加工；④生物学作用接近天然组织，功能全面，还有创面止血，缓解疼痛的作用。缺点表现为：①力学性能差，难以满足实际操作需要；②来源于异种或异体组织的胶原中，作为异物仍有一定的免疫排斥反应，有传播病源微生物（如HIV病毒、疯牛病病毒）的风险；③提取工艺复杂，工业化生产相对难度较大；④易于在创面降解，降解速度可控制性不如合成材料。此外，使用动物来源的胶原和弹性蛋白膜作为真皮替代物支架，实验表明能激发慢性炎症反应，导致组织破坏而不是组织修复。将KC和Fb接种在化学修饰的胶原膜上，适于做永久性真皮替代物，但研究表明，移植后有正常的炎症反应。因此，基于蛋白质的生物材料制成膜片时尤其应考虑免疫原性，胶原作为动物来源的蛋白，可能激发特异的或不受控制的免疫反应。可是限制胶原类支架在创伤愈合中实际使用的不是免疫原性而是储藏稳定性和制备浓缩胶原溶液所需时间的问题。

二、明 胶

明胶是胶原的变性衍生物，是一种可溶性蛋白，主要由甘氨酸－脯氨酸－羟脯氨酸序列组成，这些序列使明胶可固定水分子，从而形成螺旋结构。明胶继承了胶原的优点，又无抗原性，具有良好的生物相容性及细胞黏附能力。容易制成溶液方便使用，且价格低廉。明胶作为生长因子载体，在药物输送系统技术中广泛应用；还可与胶原、壳多糖、藻酸盐、透明质酸衍生物、碳酸钙等其他材料组成复合海绵支架；包被合成材料以促进细胞黏附、生长而在皮肤和骨组织工程中占有一席之地。

三、纤维连接蛋白

纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）是ECM的一个多功能成分，为220～250kDa的由二硫化物连接的二聚体亚单位。通过细胞结合位点和相关的协同位点，能诱导细胞黏附、伸展。其细胞黏附能力是通过几个生物活性组件实现的，如RGD三肽（精氨酸－甘氨酸－门冬氨酸序列）、第十Fn3组件。将纤维连接蛋白定向吸附于材料表面，能提高细胞结合位点的有效性，因此已开发出很多结合了Fn的生物材料。

四、糖胺聚糖

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）是重要的细胞外基质成分，主要的有硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、肝素、硫酸角质素等5类，其鉴别可见表4－1，它们都是由重复的二糖单位聚合而成的长链多糖，因为其中一个为氨基己糖，也称为氨基聚糖。透明质酸（也称透明质烷或透明质酸酯）结构最简单，不含硫酸根，不与蛋白质共价连接，而其他糖胺聚糖均与核心蛋白共价连接成蛋白聚糖。

表4－1　重要糖胺聚糖的分子结构及其在组织中的分布

糖胺聚糖链是长而无分支、不折叠且含多个重复多糖片断的多糖链，每2个多糖片断中常有一个含有氨基葡萄糖，易形成线圈样结构占据较大空间。GAG有亲水性，是多聚阴离子，呈酸性。具有充填细胞外间质、排斥负电荷并形成水合分子网及结合生长因子、蛋白酶、黏附分子等生物大分子的功能。由于其离子特性，能吸收大量水分，这种渗透性溶胀能提供压缩韧力。透明质酸具有独特的吸湿性、流变性和黏弹性，可形成开放、含水的细胞外微环境，从而有利于细胞迁移运动。透明质酸可促进Fb从细胞外基质脱离，有利于Fb的有丝分裂。在创伤愈合中，富含透明质酸的基质可促进基底细胞的增生，通过CD44介导的机制促进KC迁移，并减少胶原沉积和瘢痕形成。

细胞膜上的细胞外基质大分子受体属于整合素家族的αβ异二聚体，大多数情况下识别细胞外基质蛋白质的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）序列。在细胞的外表面，整合素连接细胞外基质大分子，而在胞质内，它们连接细胞骨架。因此，在细胞外和细胞内纤维之间形成膜桥。这种结构使细胞能黏附到基质。与激素－受体或生长因子－受体结合相似，整合素和其特异性配体相互作用能改变细胞黏附、细胞骨架结构，并能诱导直接的信号转导，影响细胞活动。糖胺聚糖还可调节细胞的形态、增生和新的细胞外基质形成。

由于糖胺聚糖类多糖在细胞黏附、增殖、分化和细胞外基质合成中的重要作用，常被应用于组织工程皮肤中。但因透明质酸易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等特性限制了它的直接应用。化学修饰、交联后的透明质酸衍生物性质更稳定。一般将其与其他天然高分子材料复合，作为辅助成分使用。糖胺聚糖可与胶原等其他水凝胶类材料共同构建生物性能更优良的水凝胶支架或交联后制成海绵支架；明胶和透明质酸钠交联形成的可降解性膜作为KC生长支架，用于构建表皮替代物；透明质酸经交联后可形成三维多孔海绵；意大利Fidia Advanced Biopolymers有限公司生产的酯化苯甲基透明质酸产品已广泛用于临床（见第一篇第1章第三节）。其他应用报道有酯化苯甲基透明质酸支架用于韧带组织工程研究，基于透明质酸的海绵治疗骨软骨缺损，基于透明质酸的非针织平片支架用作血管移植物，光交联透明质酸水凝胶用作组织工程支架。

五、纤维蛋白

纤维蛋白（fibrin）主要来源于血浆蛋白，因此具有明显的血液相容性和组织相容性，没有毒性和其他不良影响。作为止血剂、创伤愈合剂和可降解生物材料在临床广泛应用。纤维蛋白本身作为天然细胞外基质成分，有较好地介导细胞间信号传导及相互作用的性能。可作为暂时性基质，随后被ECM替代。目前以纤维蛋白凝胶的形式在临床上应用。德国生产的表皮替代物“BioSeed－S”就是将KC培养在纤维蛋白凝胶上制成的产品。可与其他生物材料，如藻酸盐或透明质酸组合，在皮肤和软骨组织工程中作为细胞输送基质使用。纤维蛋白凝胶具有良好的生物相容性和可塑性，可通过释放PDGF、TGF－β促进细胞迁移、增殖和细胞外基质合成。这种纤维蛋白凝胶来源于自身血液，避免了免疫原性问题，是较理想的细胞外基质材料。但有机械强度差、大量获取困难的缺陷。纤维蛋白可以用不同方法进行化学改性，其中包括放射性碘化法、重氮甲烷和甲醛甲基化法、与合成高分子嫁接或在纤维蛋白上进行酶固定等方法。

六、其他蛋白质衍生的生物材料

蚕丝蛋白适合于应用在需要力学特性优良、降解时间较长的组织工程化组织或器官的构建中。有人在高度多孔的蚕丝蛋白支架中接种MSCs在体外构建了组织工程软骨。

另外，基于酪蛋白和大豆蛋白的材料有希望做组织工程支架。但移植后可能引起异物反应。

七、甲壳素及壳多糖

甲壳素又名甲壳质、几丁质，是一种广泛存在于自然界（如虾蟹外壳、真菌细胞壁）中的天然高分子化合物，属于多糖，其化学名为β－（1→4）聚－2－乙酰氨基－2－D－葡萄糖，是由N－乙酰氨基葡萄糖以β－1，4糖苷键缩合而成。壳多糖是甲壳素的脱乙酰化产物，是一种聚阳离子多糖，类似哺乳动物糖胺聚糖（GAGs）结构，由β－1，4键重复链接含N－乙酰基的氨基葡萄糖单位构成，分子呈线性，含有活性的氨基和羟基，可与聚阴离子物质（透明质酸、硫酸软骨素等糖胺聚糖）形成凝胶。它具有天然、安全无毒、可生物降解成正常机体成分的良好生物相容性，还具有止血、止痛、抑制细菌和真菌、抗癌等生物学特性。由于壳多糖的良好生物降解性、组织相容性，并可促进透明质酸的合成，现已被广泛用作皮肤、骨、软骨、神经等的组织工程材料，在组织工程中的地位可与胶原媲美。壳多糖可促进KC的增殖，但超过一定浓度将抑制Fb的生长。是用作人工皮肤细胞外基质的理想材料。壳聚糖与胶原或明胶、糖胺聚糖通过真空冷冻干燥制备胶原（明胶）－壳多糖－GAGs海绵支架在组织工程皮肤、骨、软骨研究中有较多应用。在骨组织工程中还与其他材料（如羟基磷酸钙、藻酸盐等）制成复合材料应用，还用于非病毒基因载体、制药领域。壳多糖还被用于生物因子控制释放、一些难培养细胞（如人KC、血管内皮细胞、平滑肌细胞）的支持底物。另外，湿纺技术（wet spinning）生产的壳多糖纤维网、壳多糖海绵、壳多糖颗粒凝聚支架（chitosan particles agglomerated scaffolds）、可注射壳多糖细胞输送系统可用于骨和软骨组织工程，甲壳素管可用于神经再生。

胶原－壳多糖海绵适用于构建组织工程皮肤，与人Fb培养1个月，产生分化的结缔组织；接种人KC和Fb的胶原－壳多糖海绵双层皮肤替代物裸鼠移植后能促进神经再生。1994年，Damour等首次将这类人工皮肤用于临床，发现真皮替代物可通过与下层组织贴附从而代替损伤的真皮，促进微管组织的长入，移植15d后即可形成连续的上皮层。此后，Braye等以壳聚糖－胶原材料为支架培养人Fb和角质细胞形成人工皮肤，并将其移植到猪的皮肤损伤处，手术后14d发现创伤处人工皮肤在形态上类似周围正常皮肤，外观柔软、光滑、透明、呈桃红色，结果提示利用壳聚糖材料及体外培养的人皮肤细胞构成人工皮肤（真皮替代物）在临床上应用的可能。

我们制备的复方壳多糖真皮凝胶基质的科学性在于：壳多糖的游离氨基可与胶原的羟基有机结合，同时由于壳多糖带正电荷，胶原带负电荷，两者可自然地通过静电相互作用，壳多糖还可与聚阴离子的GAGs通过离子交联形成多电子复合体水凝胶。在胶原凝胶内，GAG成分（硫酸软骨素和透明质酸）既可以通过与胶原结合，又在彼此间形成复合物，使之保持和提高了凝胶的稳定。故复方壳多糖－胶原－GAGs凝胶靠离子键、化学键能够形成一个有机整体，构建理想的水凝胶支架材料。

八、藻 酸 盐

藻酸盐是从海藻中分离的一类多糖，由D－甘露糖醛酸和L－Guluronic Acid组成的共聚物。在二价离子（如钙离子）存在时，可通过离子交联作用形成水凝胶。具有价格低、来源丰富、易塑形、亲水性更好，易于细胞吸附、易于营养物质渗透等特点。但存在体内难以降解、组分不稳定（不同成品纯度不一）、有一定抗原性等缺点。有将藻酸盐与明胶经化学交联组成的可生物降解真皮替代物的报道。

九、其他动植物多糖

淀粉、纤维素等植物多糖制备的支架有用于骨、软骨组织工程的报道。琼脂糖凝胶或海绵用于软骨、神经组织工程。阿拉伯半乳聚糖（阿拉伯树胶的主要成分）、羧化芽霉菌糖衍生物（carboxylated pullulan deriva－tives）、激光熔结的聚己酸内酯／胶凝糖（gellan gum）海绵及葡聚糖（dextran）水凝胶有用于组织工程支架的报道。

十、天然聚酯

天然聚酯具有可降解、生物相容性好、可热塑性等特点，组织工程中常用聚羟基丁酸酯（PHB）和其共聚处理产物聚羟基丁酸戊酯（PHBV），单独或经多聚赖氨酸（PLYS）处理或与可溶性磷酸盐、透明质酸、磷酸钙等复合，在骨软骨组织工程中有应用。

允许酶介导细胞迁移的水凝胶（hydrogels enabling enzymatically mediated cell migration）是模拟ECM的一个有趣策略，它通过细胞分泌的金属蛋白酶水解基质，促进细胞向内生长。如特殊的细胞黏附肽、生长因子、变性纤维蛋白原片段与聚乙二醇结合形成的生物合成杂合水凝胶可促进间充质干细胞的浸润和分化。

自发装配材料（self－assembling materials）也以模仿ECM为目标，有人建议以水凝胶形式用于组织工程。通过pH诱导的自装配产生了基于两性分子肽的纳米结构纤维支架能诱导生物矿化。通过两性肽分子自装配形成的纳米纤维三维网状构造被用来包裹神经前体细胞，可很快分化成神经元。

总之，天然真皮基质拥有刺激血管形成和调节内源性生长因子的功能。目前认为，不同来源、不同种类的纤维连接蛋白、透明质酸、壳多糖和胶原，单独或组合制造的支架中接种细胞（KC和Fb），在创伤愈合应用中是有前途的。存在的问题是需要恢复活组织的连续性，将定植和重建基质所必需的几种细胞通过对创伤修复的反应进行整合，控制炎症和促血管化是努力的方向。使用不同来源的天然材料可能因为不纯和含有内毒素而诱发免疫反应，另外，由于大规模生产过程控制不力，可能存在不同批次之间的质量差异。