分子标记怎么检测等位基因位点

HLA基因分型方法适用于任何有核细胞，能分辨所有血清学、细胞学分型的抗原特异性，而且能发现血清学、细胞学分型不能检测的许多等位基因特异性，有助于进一步研究HLA系统的多态性和基因的结构与功能。随着分子生物学技术的发展，建立在DNA分子水平上的快速准确的HLA基因分型已逐步取代传统的血清学、细胞学分型方法，为临床移植提供高分辨的HLA配型。

1．分子生物学分型原理　分子生物学分型原理即为聚合酶链反应（polymerase　chain　reaction，PCR）的原理，类似天然DNA复制过程，主要利用DNA聚合酶、DNA模板等模仿体内复制过程在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。全过程分为3个阶段。①DNA模板变性：在95℃高温下DNA双链解开，形成单链DNA游离于反应溶液中。②与附加引物退火：在降低温度过程中，加入的反应体系中的两种引物将退火至相对应互补的DNA链上。严格控制复制条件，使这对引物能准确配对在扩增区域的两个侧翼。③引物延伸：调整好DNA聚合酶的最适温度，加入4种dNTP底物，使引物和模板由5′端向3′端延伸，新合成的引物可作为下一轮循环的模板而形成新的扩增片段。模板DNA经过高温变性、低温退火和中温延伸3个阶段的25～30个循环，最后形成特定的DNA片段。从理论上讲，合成产物的数量经过每轮循环反应都将增加1倍，按照2n的指数递增。但反应系统的条件和DNA聚合酶的质量对其都有影响。通常可按照公式：Y＝（1＋X）n来计算（Y为产物的倍率，X为平均效率，n为循环次数）。一般经过25～30个循环后的拷贝数可超过原底物量的100万倍以上。

2．分子生物学HLA基因分型方法　确定HLA等位基因（HLA－A，B，C，DR，DQ，DP）的分子生物学分型方法比血清学免疫技术更好地反映等位基因的多态性，目前HLA基因分型主要以5种分子生物学技术为基础：限制性内切酶消化、寡核苷酸杂交、PCR及构象分析、核苷酸测序。广泛应用于临床及基础研究的HLA基因分型方法包括：①限制性片段长度多态性（restriction　fragment　length　polymorphism，RFLP和PCR－RFLP）；②序列特异性引物PCR（sequence　specific　primers，PCR－SSP）；③PCR序列特异性寡核苷酸探针（sequence　specifil　oligonucleclide probes，PCR－SSOP）；④PCR单链构象多态性（single　stand　conformation　pilymorphism，PCR－SSCP）；⑤PCR指纹图（PCR－finger　printing）；⑥PCR－序列测定（DNA　sequencing）。

（1）RFLP和PCR－RFLP：限制性片段长度多态性（RFLP和PCR－RFLP）是DNA多态性中最多见的一种。等位基因之间由于某些核苷酸序列发生改变或者DNA分子发生中性突变，使某些限制性酶切位点数增加、减少或移位，导致限制性酶切片段长度发生改变称为RFLP。HLA等位基因的碱基序列差异导致等位基因间可产生不同的酶切片段。HLA系统中群体内共有的酶切片段称同种同型基因位，群体内不同的酶切片段称同种异型基因位。由于限制性内切酶具有独特的识别位点，通过计算机分析，选择出能识别HLA基因多态性序列的限制性内切酶，用这些酶来消化相应位点的PCR产物，通过电泳来检测各位点的酶切图谱，从而判定HLA基因的分型结果。HLA的RFLP分型是将HLA基因经限制性内切酶消化后，将酶切片段电泳分离，Southern印迹转移至尼龙膜上，然后与HLA基因座基因特异的cDNA探针杂交，从杂交片段格局中分析与抗原特异性相对应的特异杂交片段，从而分辨同种异型基因位，指定HLA等位基因。初期RFLP分型使用cDNA全长探针杂交，而由于各等位基因间核苷酸序列的同源性，杂交片段的电泳格局较复杂，结果难以分析。应用高特异性的cDNA亚探针作印迹分析则可简化RFLP格局，提高分辨率。

PCR－RFLP是结合PCR技术对RFLP分型方法进行改进的技术，是目前较常用的HLA基因分型技术之一。其原理是目的基因片段经PCR扩增后，采用等位基因特异的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，通过分析电泳图谱获得HLA基因多态性结果。

PCR－RFLP方法较简便，不需要标记探针和杂交就可满足一般的分型需要，对于检测HLA基因是一种敏感、可靠的方法。相对PCR－SSOP既简单快速，又免于同位素污染，且可精确识别单个碱基不同的序列及2个连锁的位点，尤其适合于少量标本的检测及某一亚型的研究。但也有其局限性：无法检出多态性位点与酶切位点不符的等位基因；对于高度多态性等位基因，其酶切片段长度接近，电泳图谱很难精确辨认，一般可通过与PCR－SSOP，PCR－SSP等方法结合使用来提高分辨率和可靠性。

（2）PCR－SSP：序列特异性引物PCR（PCR－SSP）方法分型的原理是根据HLA各等位基因的核苷酸序列，设计的一套针对每一等位基因特异性的（allele－specific）或组特异性的（group－specific）引物，即序列特异性引物（SSP）。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性扩增该基因片段形成与已知片段大小相同的产物，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分离及紫外透射分析阳性扩增产物的片段大小来确认不同的等位基因。

PCR－SSP分型不仅能分辨全部血清学HLA特异性，而且可根据临床及研究需要设计不同的引物，从而获得低分辨率（同血清学分型）、中分辨率（可鉴定部分基因型）、高分辨率（几乎鉴定全部基因型）的HLA基因分型，结果准确、可靠、省时，较适合于临床非亲缘关系的器官移植配型。联合应用低分辨率和高分辨率的HLAⅡ类PCR－SSP分型，可为临床同胞兄弟姐妹之间及无血缘关系的骨髓移植供受者之间提供可靠的配型结果。与其他HLA基因分型方法相比，PCR－SSP避免了杂交、酶切等步骤，结果直观，便于分析，具有简便、省时、所需样本量少、对血液质量要求不严、特异性高、技术条件易掌握等特点，是最先应用于临床的HLA基因分型技术，尤其适合于尸体器官移植的快速配型实验。但由于一些影响因素，PCR－SSP亦可能面临分型困难。如果使用的Taq酶质量不高，则可能在室温下样本体系加样操作时即有扩增，产生非特异性产物。因此，使用高质量的Taq酶，优化PCR反应，通过设计等位基因特异性及组特异性引物来相互确认扩增产物，可提高分型的精确性。

在肾脏移植中，PCR－SSP方法可在2～3h内完成零散或少量样本的快速HLA分型，结果准确性高，是临床肾脏移植组织分型的最适宜技术。

（3）PCR－SSOP：PCR序列特异性寡聚核苷酸探针（PCRSSOP）的原理是先用PCR方法扩增HLA基因多态性区域即第2外显子区，然后用放射性同位素标记的已知探针与PCR产物在一定条件下杂交，即将PCR产物固定于杂交膜上，然后与各种特异性探针在不同的条件下杂交，通过放射自显影判定结果。阳性表示有相应的特异性序列，以确定PCR扩增产物HLA多态性的类型。探针可采用同位素或非放射性如地高辛、生物素、过氧化物酶等标记，经放射自显影、显色或化学发光检测结果。如果探针与样本DNA结合则出现阳性结果；反之，探针在洗膜过程中被洗脱则出现阴性结果。序列特异性寡核苷酸探针是根据HLA基因多态性区域的序列差异来合成的。

PCR－SSOP可分为两种类型：正向杂交和反向杂交。正向杂交是将样品DNA－PCR产物固定于杂交膜上，使各种SSOP探针与之杂交；反向杂交是将一套设计好的等位基因序列特异性寡核苷酸探针预先固定于特殊杂交膜上，然后与标记生物素的PCR产物杂交。如果扩增产物与杂交膜上的序列特异性寡核苷酸探针互补，则此生物素标记的扩增产物就会与之杂交固定于膜上。加入亲和素和碱性磷酸酶通过显色反应判断HLA基因特异性。用一次杂交反应就确定了PCR产物的等位基因类型，较正向杂交法更为简便，适于大样本的等位基因水平分型。

PCR－SSOP分型已广泛应用于免疫遗传学领域，目前初步应用于移植配型领域，尤其适合大样本的筛查，也是鉴定新的等位基因的有效方法。SSOP探针除能决定相应抗原特异性基因外，还可精确地分辨出相应抗原、基因座上的等位基因顺序的多态性，是一种高分辨率的基因分型方法。PCR－SSOP不需要大片段、较完整的DNA，且具有试剂来源广、结果精确等优点，避免了电泳在鉴定不同系列凝胶中DNA片段大小时存在的误差。但PCR－SSOP也有其局限性：洗膜温度、离子浓度必须严格而一致；理论上不能分辨引物、不能扩增或SSOP探针不能识别的等位基因特异性；需要使用大量寡核苷酸探针，且杂交后洗膜条件因每种探针而异；探针较昂贵。因此这种高分辨率的分型方法适合于临床研究。

（4）PCR－SSCP：PCR单链构象多态性（PCR－SSCP）分型法使用同位素标记的引物进行HLA基因片段扩增。含同位素的扩增产物在变性剂作用下打开双链，形成单链DNA，由于各等位基因间核苷酸序列不同，单链DNA二级结构产生差异，自身折叠形成具有一定空间结构的构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，呈现不同的迁移率，经银染后表现为不同的泳动区带，从而形成HLA基因多态性格局。PCR－SSCP分型法灵敏度很高，可检测出等位基因单个核苷酸的转换。该技术简便可靠，不要求目的基因含有限制性内切酶酶切位点或探针的特异性杂交序列，在器官移植中可用来比较供、受者基因是否一样。

采用PCR－SSCP技术可以直接比较供、受者之间HLA基因是否完全一致，且可精确到一个碱基之差，具有简易、快速、经济等优点。但PCR－SSCP分型的影响因素较多，主要有两大方面：一是影响PCR扩增特异性的因素均可影响PCR－SSCP分型，如不同位点的基因扩增产物，由于片段、长度及碱基序列不同，所选择的SSCP的条件也不同；二是影响PCR产物电泳的因素，包括聚丙烯酰胺凝胶浓度和交联度、电泳温度、凝胶中丙三醇（甘油）的浓度、电泳缓冲液离子强度等，而且不同位点的扩增产物其分析条件也不相同，因此技术条件不易掌握。

PCR－SSCP分型一般临床应用较少，主要用于HLA微观多态性研究或其他分型方法难以准确分析时的分型手段。

（5）PCR－finger　printing：PCR指纹图（PCR－finger　printing）的原理是HLA基因具有高度的同源性。在退火期，各个基因的单链DNA除形成各自完全互补的纯合双链外，某些单链DNA还可以与其异源基因的单链DNA配对形成不完全互补的异质双链。不同个体形成不同的分子构象，利用同质双链和异质双链及异质双链之间的分子构象不同，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为迁移率的不同，可获得单倍型特异的电泳带格局即PCR指纹。PCR指纹法适用于快速的同种异型DR／DW配型。

DR／DW纯合子个体的PCR指纹法是按照DRB基因第二外显子的保守序列设计引物，使DR基因座的DRB1，DRB2，DRB3，DRB4和DRB5基因均有扩增产物。在PCR退火时，每个基因的单链DNA产物各自形成完全互补的同质双链（homoduplexes），但有一部分单链DNA产物在异源基因之间形成不完全互补的异质双链（heterduplexes），错配处形成单链环状结构。在DR／DW纯合子及杂合子个体中，每种DR单倍型及每两种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位置各异，电泳时形成单倍型特异的电泳带格局，个体间PCR指纹相同说明DR／DW型相同。DR／DW杂合子个体PCR指纹法则是通过混合相应型别的HTC，扩增后分析相应HTC所没有的电泳带局。利用PCR指纹法作DNA交叉配型实验可为移植病人和无关供体提供快速、准确的配型。混合2个不同个体基因组DNA，将其PCR指纹与各自的PCR指纹比较，如果它们的格局完全一致则DR／DW型别相同；反之则有额外电泳带形成。

该方法是一种快速简易的方法，尤其适用于不相关的骨髓移植供受者的挑选。可以先混合供受者的基因组DNA，再进行PCR扩增，将混合DNA的PCR指纹与供、受者各自的PCR指纹做比较。如果他们的电泳图谱一致，说明供受者相匹配，否则不匹配。但是该方法需要较严格的电泳条件，需同时进行供受者的电泳，以利于在同等条件下进行比较。该方法只能判定供受者是否相合，难以确定等位基因的特异性。

（6）PCR－序列测定：该方法是先将等位基因扩增，再进行DNA测序。它能达到最高的分辨率，能对所有已知和未知的HLA基因进行分型，且能发现新的等位基因。但该方法要求条件高，技术复杂，所需设备昂贵，一般实验室难以达到且检测时间长，难以在临床普及。