肿瘤的浸润与转移

肿瘤转移是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程，被形象地称为多阶梯瀑布过程。各种肿瘤转移的基本过程是相似的，它们包括以下步骤：①原发癌灶中癌细胞增殖与生长；②肿瘤血管生成；③肿瘤细胞脱落并向周围组织浸润；④癌细胞分泌产生多种降解酶类，降解细胞外基质及基底膜，突破入脉管循环；⑤癌栓形成，进入血循环的肿瘤细胞在运送过程中大多数都被杀死破坏，只有极少数转移倾向极高的细胞相互聚集形成微小癌栓自泌性运动因子（AutocrinMotility FactorAMF）等因素的作用下移行；⑥肿瘤细胞运行至靶器官，游离出血管外，到达继发部位，肿瘤细胞黏附于靶器官血管内皮细胞，附着于基膜上，通过瘤细胞表面的黏附分子——整合素（ Integrins）完成这一步骤，癌细胞分泌多种蛋白分解酶，溶解基膜，进入细胞外质；⑦与继发部位组织黏附，形成克隆，肿瘤细胞增殖与血管新生，形成转移灶。

在肿瘤转移的一系列步骤中，下述机制发挥了重要作用。

（一）肿瘤浸润

肿瘤浸润即肿瘤细胞侵犯和破坏周围正常组织，进入循环系统的过程。如前所述，肿瘤浸润和转移是恶性肿瘤生长发展中密不可分的相关过程，肿瘤浸润是肿瘤转移的前提，但并不意味着有浸润就必然发生转移，然而肿瘤转移必定有浸润。肿瘤浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动、基质内增殖等一系列过程的表现，肿瘤浸润作为肿瘤转移的起始阶段包括以下几个过程。

1.肿瘤细胞的增殖和扩展　肿瘤细胞的不断增殖是恶性肿瘤浸润的前提。随着细胞增殖导致肿瘤组织内部压力增高，该扩张性压力有利于癌细胞向压力低的方向侵袭和转移。有人认为恶性肿瘤组织内压力比正常组织高，导致其侵袭力也较强。也有人观察到相反现象，即生长较快的乳腺纤维瘤却不发生侵袭，而有高度侵袭能力的乳腺硬癌，其生长是缓慢的。体外实验证明，将正常组织和小块癌组织放在一起，在相互接触而没有产生压力的情况下进行培养，显示癌细胞仍然可侵袭正常组织，提示侵袭与增殖活性以外的其他因素有关。一般认为，增殖活性是肿瘤侵袭、转移的基础和前提，但侵袭与转移的实现还取决于肿瘤细胞对正常组织的破坏能力，肿瘤细胞的运动能力已经对侵袭转移中所遭遇环境的适应性等因素。

2.肿瘤细胞的分离脱落　恶性肿瘤细胞的侵袭过程，首先是从瘤母体分离，然后再向周围组织侵袭。瘤细胞的分离倾向与细胞结构的变化和黏附能力下降密切相关。黏附在肿瘤细胞浸润过程中起到重要作用。肿瘤细胞自原发灶脱落后，需要借助黏附才能移动。而连续的黏附和脱黏附，瘤细胞获得一个连续的移动动力，到达继发部位后黏附增生，形成转移灶。介导细胞—细胞，细胞——基质黏附的成分主要有：细胞黏附分子，包括整合蛋白家族（integrins），选址素及其他黏附分子、钙黏蛋白、免疫球蛋白家族等。

肿瘤细胞表面存在的多数微绒毛和足突能影响细胞的彼此接触。重要的生化成分即糖蛋白在细胞恶变过程中发生糖基化，尤其是唾液酸化，从而导致糖蛋白分子增大、糖链分支增加，减少了ConA的甘露糖特异性结合位点，影响细胞间的识别、联系和黏附力。从分子角度分析，肿瘤细胞间存在一族调控细胞与细胞之间的黏附作用的分子称为钙粘连素。他们是钙依赖性跨膜黏附因子，具有同种分子亲和性。细胞胞质内的钙粘连素与胞质内连接素结合使其与细胞骨架紧密结合，形成钙粘连素-连接素复合体，起到稳定肿瘤细胞间连接的作用。因此认为，在肿瘤发生、发展的各个阶段，钙粘连素对维持多细胞结构起到至关重要的作用。有人观察到，多数分化程度较好的肿瘤可具有E-钙粘连素高水平表达，而分化程度低的肿瘤则表达水平低。当肿瘤细胞E-钙粘连素基因发生突变时，可使非侵袭性肿瘤变为高侵袭性肿瘤。若将E-钙粘连素cDNA转染进入高侵袭性肿瘤细胞中，这些细胞的侵袭性和运动性受到极大限制。此外，肿瘤细胞表面电荷增多以及细胞间隙压力的增加都可能促进癌细胞从原发肿瘤分离脱落。

在肿瘤浸润转移过程中，细胞外基质屏障作用的破坏是重要的一个环节。肿瘤细胞通过其表面受体与基质中的各种成分黏附后，激活和分泌多种蛋白降解酶类降解基质。不同的基质成分由相应的酶来降解。这些降解酶主要为蛋白酶类：丝氨酸蛋白酶类、金属蛋白酶类、弹性蛋白酶类、巯基蛋白酶类，门冬氨酸蛋白酶及肿瘤相关胰蛋白酶原。

当肿瘤细胞从原发肿瘤分离脱落后，必须穿透原发肿瘤周边的宿主结缔组织才能进入脉管系统。这些结构即细胞外基质主要由胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖4种分子组成，不同组织器官各组分比例不同。这些细胞外基质的重要组分对组成和稳定细胞外基质蛋白与蛋白之间、多糖与蛋白之间结合起关键作用。这些结构的降解有利于肿瘤细胞的侵袭转移。肿瘤细胞本身可产生多种分解酶，包括尿激酶型纤溶酶、组织型纤溶酶、组织蛋白酶、透明质酸酶、Ⅳ型胶原酶、基质溶解素、肝素酶和凝血素等。这些有机成分可分解细胞外基质和基膜。此外，肿瘤细胞的一些代谢产物如多肽、乳酸等也可进一步溶解小血管基膜，有助于肿瘤细胞侵入循环系统。

3.恶性肿瘤细胞的运动性和趋化性　在侵袭过程中，各种溶解酶破坏肿瘤细胞外基质的同时，肿瘤细胞必须移动进入基质，组织特异性趋化因子和结合趋化因子能增强肿瘤细胞的运动性，但肿瘤细胞的自身运动也是必不可少的。早在1863年病理学家Virchow就提出肿瘤细胞具有阿米巴运动，现已被国内外研究者所证实。多数学者观察到，具有侵袭性的肿瘤细胞有较强的运动性，主要表现为伪足样伸展、膜流动性及向量转化等。

肿瘤细胞的运动较类似白细胞的运动方式。运动过程包括细胞运动前缘与基质的黏附和细胞后缘的去黏附；细胞间丝状聚合素进行性分解以后再合成都有助于肿瘤细胞的伪足样伸展。这是个重复协调的过程，许多机制尚不清楚。目前已知许多因子可促使肿瘤细胞运动。

（1）刺激肿瘤细胞运动和侵袭的因子，如自分泌运动因子（AMF），原发部位的肿瘤细胞能分泌AMF，当AMF增高达到一定水平时，可经细胞上的受体刺激细胞运动。

（2）刺激肿瘤细胞生长和运动的因子，如表皮生长因子、类胰岛素生长因子、肝细胞生长因子，以及多种细胞因子包括IL-1、IL-3和IL-6等。

（3）刺激肿瘤细胞运动但抑制其生长的因子，如转化生长因子、干扰素等。这些运动因子影响肿瘤细胞表面受体的分布，并调节肿瘤细胞运动过程中细胞与细胞之间、细胞与基质之间的结合。这种调节可能是通过改变受体的配子结合密度来协调细胞黏附和去黏附的周期过程。这个过程至少包括：①肿瘤细胞受体与周围基质配子的结合；②配子-受体结合使调控信号进入细胞内；③细胞支架移动使细胞伪足样伸展运动。另外，恶性细胞定向移动取决于其内部功能性微管复合体的完整性，定向移动在恶性肿瘤侵袭过程中可能起主要作用。

（二）肿瘤转移

通过侵袭方式进入机体循环系统的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡。导致肿瘤细胞死亡的原因可来自肿瘤细胞本身或来自宿主的环境因素。肿瘤本身的因素可以是细胞自身缺乏变形性以至不能顺利通过循环系统；也可能是细胞缺乏形成癌栓的能力，或是肿瘤细胞表面缺乏黏附因子。宿主因素则是多方面，机体的免疫系统在清除肿瘤细胞过程中扮演了重要角色，如自然杀伤细胞。巨噬细胞及血小板等，血液湍流可加速肿瘤细胞的破损；毛细血管的垂直压力对正在通过的肿瘤细胞也是重要的损伤因素；此外，由细胞素激活的内皮细胞产生的一氧化氮被认为是非特异杀伤进入循环系统中肿瘤细胞的重要因素。只有具有高度转移潜能的肿瘤细胞才能逃逸上述种种易损因素，通过循环系统到达继发脏器，锚定黏附，逸出血管，最终在继发脏器增殖生长形成转移癌灶。

1.肿瘤细胞的锚定黏附　由于上述的多种因素使大多数进入循环系统的肿瘤细胞在转运过程中被杀灭，唯有少数活力高且有高转移潜能的肿瘤细胞存活下来，并相互聚集形成微小肿瘤栓簇。当到达特定继发脏器时，肿瘤必须牢固地附着在脉管内皮层，这是为以后逸出血管进入继发脏器基质增殖生长的先期准备和必要条件。在通常情况下，毛细血管内皮细胞周期性频繁脱落更新。因此，磨损或撕裂的内皮可以形成暂时的裂隙，使基底膜暴露在外。这种内皮的损伤和基膜的暴露为肿瘤细胞的成功附着提供了基础。肿瘤细胞在循环系统转运过程中与血小板相互作用并绞结成簇，当脉管内皮损伤时有助于血小板的黏附，内皮细胞修复早期形成的纤维蛋白原可增强血小板的黏附能力。肿瘤细胞-血小板簇可通过血小板与损伤内皮的黏附锚定在内皮表面，这是肿瘤细胞在继发器官定位附着的关键环节。

另一种肿瘤细胞锚定附着的方式可能是一些较大的癌栓被微小脉管截获。由此可认为高转移潜能肿瘤细胞容易在循环系统中形成较大癌栓，进而有较大机会在继发脏器着床存活，最终形成转移。这些高转移潜能的肿瘤细胞可以自身相互聚集形成同类癌栓，也可以与白细胞或血小板绞结成簇形成异类癌栓。癌栓可以在脉管系统中通过楔入附着于管壁上，任何生理性、生化性或由于缺氧等所造成内皮细胞的损伤都有助于肿瘤细胞的锚定和附着。

肿瘤细胞锚定黏附过程受多种因素调节。在脉管内皮细胞表面有选择素系列黏附因子。选择素通过与肿瘤细胞表面碳氢类配子结合，使肿瘤细胞完成与内皮细胞的最初黏附。某些肿瘤细胞如结肠癌细胞表面富含黏液样碳氢物质，使其容易与内皮细胞表面相应的选择素结合，结果赋予结肠癌较强转移倾向。

2.肿瘤细胞逸出循环系统　逸出循环系统涉及到脉管基膜的降解和穿透以及肿瘤细胞穿过脉管后在结缔组织中的移动。局部脉管基膜的缺损通常伴随癌肿转移，而良性病变则无此改变。当肿瘤细胞与脉管内皮黏附后，可诱导内皮细胞回缩，从而暴露细胞外基质。肿瘤细胞可以与细胞外基质的有机成分结合，这些有机成分包括纤维结合素、层黏素和血小板反应素，它们可促进肿瘤转移定位在特异的脏器。而细胞外基质中的多肽系列则可阻止血行性转移的形成。

在肿瘤逸出血管进入脏器基质的过程中可分泌释放多种蛋白溶解酶，这些酶的种类和功能与肿瘤细胞侵袭过程中分泌释放的相类似，在此不再赘述。不同组织器官基质的有形成分因自身特有性质而不同，如骨结构、胶原结构等，使它们对不同的蛋白溶解酶反应不同，从而决定了各种脏器发生转移瘤灶有不同的易感性。

3.肿瘤细胞定位生长　肿瘤细胞进入继发脏器基质后并不意味转移一定形成，只有当侵入继发脏器基质的肿瘤细胞增殖形成转移瘤灶并进行性长大才真正实现癌转移。当肿瘤转移细胞与继发脏器细胞接触时，可反应性通过自分泌、旁分泌或内分泌方式产生多种信号因子，这些因子可以单独或联合调控肿瘤细胞的增殖生长。此类因子包含有正调节信号和负调节信号并处于一种动态平衡状态。

通过宿主自分泌和旁分泌机制产生的生长因子可调控脏器组织的修复或更新。如TGF-a和HGF可促进结肠上皮细胞和肝细胞的修复和更新。当正常组织收到损伤如转移肿瘤灶的侵袭，这些生长因子可产生并发挥正常修复效应。但遗憾的是这些因子在促进正常组织修复更新的同时，也刺激转移瘤灶细胞的增殖生长。

如原发肿瘤一样，当转移瘤灶体积增长到一定程度时，新生毛细血管网也随之形成。转移瘤灶的肿瘤细胞亦可以通过脱落。侵袭进入循环系统产生二级转移瘤灶，这就是所谓的“转移之转移”。

（三）肿瘤浸润转移的因子促进机制

多种细胞因子可以促进癌细胞的游走转移，现已证明多种因子与细胞移动有关，这些因子分产生并作用于自身细胞的自分泌型和由其他细胞产生而作用于靶细胞的旁分泌型2大类。

1.自泌型运动促进因子自分泌运动因子（AMF），自身毒素（autoxin ATX），浸润刺激因子（Invasion Stimulating Factor，ISF），及转移刺激因子（migration Stimulating Factor，MSF）等。AMF是细胞自分泌的活性刺激因子，其受体是78×103的糖蛋白（gP78），具有不同转移能力的癌细胞其gP78表达特性明显不同，在高转移细胞株中，gP78集中分布且数目增多，而低转移株中多散在分布。ATX在一定浓度时可诱导细胞游走。有证据表明MSF可使细胞转移活跃，且有促进透明质酸酶产生的作用，增强破坏细胞外基质，从而使细胞移动性增强。

2.旁分泌型运动促进因子，包括C3b样因子和肝细胞生长因子（Hepatocyte Grouth FactorHGF）。C3b样因子能增强肝细胞转移细胞对肝窦内皮细胞的黏附性，而且还是促进肝转移细胞转移的主要因子。

（四）肿瘤转移的基因调控机制

现有的研究表明，许多基因的异常表达与肿瘤的转移有关。

1.转移基因（metastatic genes）　是指基因的表达和改变能够促进和导致肿瘤发生转移的基因。Ras、Myc、V-mos、V-raf、V-src、V-fes 和V-fms基因及突变的p53基因在合适的宿主细胞内，可不同程度地诱导转移类型的表达。Ras和Myc基因的异常表达和变化在肿瘤发展和转移过程中能不依赖原发肿瘤细胞的调节而起作用。转移基因mts是Ebmlidze等于1989年在鼠乳腺肉瘤细胞株中分离出一种基因，其MRAN约0.55Kb，编码分子量为101个氨基酸的蛋白质，称为转移基因mts，此基因在转移细胞中高度或中度表达而在肺转移细胞中不表达。克隆的人mts基因和鼠mts基因十分相似。Grigorian等的工作说明了mts的过量表达与肿瘤细胞的转移能力呈密切正相关。

2.转移抑制基因Nm23　1988年steey首次从小鼠黑色素瘤细胞系中分离出Nm23基因，后经研究定位于17号染色体长臂远端（179）。Nm23基因编码蛋白与人工红细胞二磷酸核苷酸激酶（NDPK）高度同源，经研究分析Nm23-H1编码的蛋白与NDPKB链一致，Nm23-H2编码的蛋白与NDPKB链一致。ND-PK与蛋白合成有关，它参与微蛋白的解体，参与G蛋白介导的信息传递，直接影响细胞的构型、运动、黏附及分裂增殖。研究证实：肿瘤细胞的Nm23基因表达与转移潜能呈正相关，Nm23基因的低表达已在多种高转移潜力肿瘤中被证实。

Kodera的研究证实了胃癌高转移与Nm23-H1，mRNA低表达的对应关系。而Nakayama和Yamguchi等的研究揭示了肝癌患者Nm23-H1、Nm23-H2低表达与预后的关系。通过大量研究证实，在乳腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、甲状腺癌、前列腺癌及肺癌等，均发现Nm23基因及其产物的低表达与疾病的进展及高转移潜能呈明显负相关，Nm23基因及其产物的低表达，也成为预后差的一个重要指标。

（五）肿瘤浸润转移的信息传导机制

在肿瘤浸润转移整个过程中，都有信息传递参与，信息的传导大多循以下通路进行。

1.JAK-STAT信号途径　JAK是一种重要的酪氨酸蛋白激酶，STAT是一种重要的核转录因子。细胞因子与受体结合后激活JAK，再进一步激活STAT。研究发现，STAT3在多种肿瘤组织中异常表达和激活，并与肿瘤的增殖、分化、细胞凋亡、血管生成、浸润转移和免疫逃避密切相关。STAT3蛋白的活性形式在多种肿瘤的侵袭和转移过程中起着重要的作用。例如胸腺上皮细胞瘤、结直肠腺瘤、具有淋巴结转移的皮肤鳞状细胞癌等。有人通过研究发现，STAT3表达高的肿瘤细胞，MMP2表达也较高，通过转染STAT3至侵袭性较差的肿瘤细胞，观察到STAT3可直接与MMP2启动子结合并刺激MMP2表达上调。认为STAT3通过刺激MMP2的表达增加了肿瘤的侵袭和转移。Dechow使用免疫组化的方法发现在乳腺癌的发展过程中激活的STAT3与MMP-9具有明显相关性。

在原位胰腺肿瘤动物模型中，阻断STAT3的活性可明显抑制VEGF的表达、血管生成和胰腺肿瘤的肝转移。大鼠的黑色素瘤模型中，沉默STAT3的活性可明显减少MMP-2的表达，降低黑色素瘤的肺转移。增强STAT3的活性可以使黑色素瘤细胞MMP-2、VEGF表达升高增加肿瘤的侵袭和血管生成，从而使转移能力增强。激活的STAT3蛋白在人黑色素细胞瘤脑转移灶明显高于原发灶。

尽管STAT3参与正常细胞因子信号的调节，但是在越来越多的肿瘤细胞中发现STAT3的持续性高表达，而且有证据证实STAT3参与了肿瘤的发生和发展，表明STAT3有可能成为肿瘤治疗中一个新的治疗靶位。阻断STAT3信号传导途径，可促进细胞凋亡，抑制肿瘤的侵袭和转移，为肿瘤的治疗提供了一条可行之路。Ling在大鼠乳腺癌模型中用RNA干扰技术降低STAT3的活性可明显抑制肿瘤的侵袭和转移。Weerasinghe等通过体外实验证明G-四联体寡聚脱氧核苷酸可明显抑制非小细胞肺癌细胞STAT3的结合活性，降低其下游基因Bcl-x、Mcl-1、VEGF等表达。从而促进肿瘤细胞的凋亡和血管生成。有人通过实验证实STAT3诱导单核苷酸可高效的转染入肺癌细胞株，明显降低Mcl-1、Cyclin D1、Bcl-xl的表达。认为以STAT3为靶点对于肺癌的治疗具有巨大的潜力。

2.MAPK途径　MAPK信号通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号传导系统，受刺激后发生磷酸化而活化。调节着细胞的生长、分化、分裂、死亡以及细胞间功能同步化过程。在真核细胞已经确定出4条MAPK信号传导通路，即ERK（extracellular signal regulated kinase）、JNK（c-Jun N-terminal kinase）、p38MAPK（p38 mitogen activated protein kinase）、ERK5（extracellular regulated kinase 5）。ERK通路，即Ras-to-MAPK通路，是MAPK系统主要的和经典的通路，主要传递细胞丝裂原信号，参与调节细胞周期及促进细胞增殖分化。

近年来发现MAPK在细胞恶变和肿瘤侵袭转移过程中起重要作用。Mehta研究发现与良性前列腺组织相比，ERK5上游激酶MEK5在前列腺癌细胞中表达增加，也证实MEK5的高表达与前列腺癌细胞骨转移相关。MEK5的转染实验可以诱导前列腺癌细胞增殖、增强癌细胞活性并促进癌细胞转移。因此证实MEK5是一个与前列腺癌转移有关的关键的信号分子。在早期的肠道肿瘤发生过程中，MAPK途化促进MMP-7的表达。在大肠癌中，活化Ras-to-MAPK通路在诱导VEGF的表达起重要的作用。这些基因均可促进肠道肿瘤的侵袭和转移。有人研究乳腺癌的癌细胞经TGF-β刺激可进一步增殖侵袭和转移，它的分子机制是通过激活p38MAPK信号途径促进了侵袭转移相关的基因的表达。Tanaka研究发现，在卵巢癌细胞株TGF-β可促进u-PA的表达，从而增加肿瘤细胞的侵袭性，其机制是TGF-β通过激活MAPK通路上调u-PA的表达，增加肿瘤细胞的侵袭。阻断MAPK信号通路，可抑制雌激素依赖性妇科肿瘤如子宫内膜癌、卵巢癌细胞的增殖。Hsiao通过体内试验和体外实验，MAPK抑制剂可使肿瘤细胞株的MMP-2和u-PA的表达下降，降低肿瘤细胞的侵袭性。说明在肿瘤细胞侵袭和转移的过程中，MAPK信号通路可能是起重要作用的信号通路，阻断MAPK途径为肿瘤侵袭转移的治疗提供了新的方向。

3.Wnt途径　在正常成熟细胞中，Wnt通路处于关闭状态，胞质中的β-catenin大部分与突出于细胞膜的E-cadherin结合。目前发现Wnt信号途径激活有3条途径是：Wnt/Ca2+途径、平面细胞极性途径和正规Wnt途径。当Wnt通路处于激活状态时，β-catenin不被降解，而是逐渐积聚进入细胞核，与转录因子相互作用，启动转录过程，调控相应的基因表达。人类肿瘤如乳腺癌、食管癌、结直肠癌、恶性黑色素瘤、白血病、前列腺癌、子宫内膜癌、原发性肝癌、甲状腺癌、胰腺癌等均存在Wnt通路异常。有许多研究已经证明在肿瘤的发生和进展中Wnt信号通路发挥着作用。

Lowy通过实验证明Wnt信号活化可以上调MMP-3，促进胃癌细胞的侵袭和转移。Brabletz认为Wnt信号通路的活化可促进结直肠癌细胞的局部侵袭。Neth证明了正规Wnt途径与干细胞和肿瘤细胞的侵袭密切相关。在肿瘤的侵袭过程中也有Wnt途径的异常激活。Lindvall在乳腺和其他组织干细胞和祖细胞的分化过程中发现，Wnt信号通路起着重要的作用，异常活化的Wnt信号通路可诱导乳腺干细胞和祖细胞分化成癌细胞。

活化的Wnt/β-catenin信号在不同组织肿瘤细胞的发生和进展过程起着重要的作用，抑制Wnt/β-catenin信号将是合理的肿瘤治疗靶点。Kim通过体内试验和体外实验证明，Wnt通路抑制因子可以抑制肺癌细胞的生长。说明Wnt通路在肺癌的发展中起重要作用。此外，Schlange研究表明，干扰Wnt信号途径可以降低乳腺癌细胞株的增殖和存活。在配体受体水平干扰Wnt信号途径联合其他靶点可以提高乳腺癌的治疗效果。

4.Notch途径　Notch信号通路是细胞间信息交流的重要通路，在组织神经发生，血管生成方面有着重要的调节作用，在哺乳动物中共发现4种Notch蛋白。Notch信号在不同的组织和器官有着不同的作用，如促进或抑制肿瘤的分化和转移。这可能与细胞所在的微环境或Notch受体、配体等信号通路中相关分子的表达量不同有关，这种不同最终影响细胞在增殖、细胞周期抑制、分化、自我更新或凋亡等命运选择上的不同。

综上所述，肿瘤的侵袭转移与多种因素参与，多水平调节有关，多种细胞因子、黏附因子、细胞骨架、转移基因参与其中，且呈现相互作用的复杂机制。进一步对这些机制进行更深入的研究，必将对肿瘤浸润转移的揭秘和肿瘤的防治及预后的研究起重要的促进作用。

（马　丁　奚　玲）