病毒感染性疾病

病毒在自然界分布广泛，可感染细菌、真菌、植物、动物和人，常引起宿主发病。但在许多情况下，病毒也可与宿主共存而不引起疾病。

国际病毒分类委员会(intennational commitlee on nomenclatme of viruses，ICNV)第七次报告(1999)，将所有已知的病毒根据核酸类型分为单链DNA病毒，双链DNA病毒，DNA与RNA反转录病毒，双链RNA病毒，单链RNA病毒，裸露RNA病毒及类病毒等八大类群，此外，还增设亚病毒因子一类。该报告认可的病毒约4000种，设有3个目，64个科，9个亚科，233个属，其中29个属的病毒为独立病毒属。亚病毒因子类群，如卫星病毒和朊粒，不设科和属。一些属性不明确的属称为暂定病毒属。

(一)肝炎病毒

病毒性肝炎流行全球，传染性强，已成为当前威胁人类健康的重要疾病。全世界已有几亿人感染肝炎病毒，每年约有几百万人直接或间接死于肝炎或与之有关的疾病。病毒性肝炎主要由肝炎病毒感染人体后引起，以肝脏炎症损伤和坏死病变为主，并常伴全身性反应。下面以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的分子诊断及其临床应用为例说明。

HBV属嗜肝DNA病毒科，又称Dane颗粒，DNA呈双股环形，是乙型肝炎病毒感染的直接证据。HBV-DNA阳性结果表明血液中存在大量病毒，具有高度传染性，但阴性结果并不能排除相对低浓度的病毒存在。对HBV-DNA的检测，一是定量检测，主要采用实时荧光定量PCR技术：二是对病毒进行基因分型和耐药变异分析。无论是用干扰素还是核苷类似物进行抗病毒治疗，病毒的载量的下降是考核疗效的重要指标，所以DNA定量检测是非常必要的。在HBV的药物治疗过程中，DNA载量下降的速度和幅度对预测抗病毒治疗的疗效具有重要价值。同时，对乙肝病毒进行基因分型和耐药变异分析，有助于医生更换药物或者更换治疗方案。

HCV为线状单股正链RNA病毒，属黄病毒属，是丙型肝炎的病原体。HCV最初从输血后黄疸性肝炎患者的血清中检出，曾称为输血后肝炎。HCV的传染方式与HBV相同，主要是经输血、性接触和母婴垂直传染。HCV-RNA由编码区、5′-非编码区和3′-非编码区组成。编码区包括结构区与非结构区。结构区较保守，非结构区易发生变异。结构区编码的产物分别是核心蛋白、基质和囊膜蛋白。非结构区编码的产物依次为NS1、NS2、NS3、NS4和NS5蛋白。其中NS1蛋白可能是可溶性补体结合抗原，NS3为HCVRNA的螺旋酶，NS5为HCV-RNA指导的RNA多聚酶。

HCV-RNA阳性是HCV感染的证据，表明存在活动性感染、且有传染性。HCV感染后，在血抗HCV抗体出现和转氨酶升高之前病毒载量已达高峰，当血中抗体出现后，病毒水平显著降低。因HCV-RNA较抗HCV抗体出现早，故HCV-RNA可用于早期诊断及献血员的筛查。血抗HCV阳性，HCV-RNA阴性，提示HCV已被清除或处于极低水平，应进行随访观察。HCV-RNA载量测定也可作为判断预后和抗病毒治疗疗效的指标。对HCV-RNA载量的检测，主要采用实时荧光定量RT-PCR技术。

(二)人乳头瘤病毒感染

人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)在人类中的感染非常普遍，它是一种可引起人类皮肤和黏膜组织良性及恶性肿瘤的病毒。迄今为止，已发现的HPV有100多个型别，各型别与体内特定感染部位和病变有关，其中40多个型别与人类生殖道疾病有关。

由于HPV病毒尚未从活细胞里分离成功，因此难以用细胞培养方法培养HPV。人感染HPV后，机体产生的抗体主要是衣壳蛋白，可在体内长期存在，血清学方法检测抗体不能确定是近期感染还是既往感染。因此，发展新的诊断方法主要依赖于分子生物学技术，实现对病毒DNA的检测。目前，用于HPV分子诊断的方法有如下几类。

1.原位杂交技术　用于研究宫颈组织细胞内是否含有HPVDNA，该法灵敏度虽低，但是无需从组织细胞中提取核酸，即能对成分复杂的组织进行单一细胞的研究而不受细胞内其他成分的影响，并可完整地保持组织和细胞的形态。该技术目前主要应用于科研工作，尚无快速准确的临床筛查诊断产品。

2.第二代Digene杂交捕获试验　是一种非放射性信号放大技术，针对HPV-DNA标记RNA探针与目的基因进行杂交，形成的RNA-DNA混合物被标记有特异性单克隆抗体的微孔板捕获，通过加入底物进行化学发光比色，得到一个半定量结果。该技术使用两种特异性探针：低危型探针和高危型探针，用以区分低危型与高危型。其缺点是不能对HPV进一步分型与定量，其灵敏度稍低于PCR法，试剂昂贵，检测成本高。

3.型特异性PCR和通用引物PCR　针对单一型别HPV设计型特异性引物并进行PCR扩增，一次试验只检测到一种基因型。此方法操作繁琐、费用昂贵，逐渐被通用引物所代替。通用引物就是在HPV基因组的保守区设计针对HPV不同基因型的通用PCR引物，由于L1区是HPV基因组中最保守的区域，目前大多数引物设计均选择该区域，使用通用引物一次可检测多个HPV的基因型。

4.实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)　既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。此外，还具有重复性好、操作简便、价格低廉等优点。实时荧光定量PCR与PCR不同之处在于前者反应体系中除了有针对HPV的特异性引物之外，还加入了带有荧光标记的荧光探针，利用扩增过程中荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。目前国外已有上市的成型试剂盒(ABAnalitica的RQ-HPV-PCR试剂盒)，经过国内的600例临床试验研究证明，该法特异度达99.7%，灵敏度达100%，重复性好，分型的同时还可以准确定量，且结果直观可靠，客观性强，适用于临床HPV感染的筛查与宫颈病变程度的预测以及患者术后疗效的观察。实时荧光定量PCR主要有单通道与多通道之分，多通道实时荧光定量PCR是检测HPV感染的发展趋势之一。

5.HPV基因分型芯片技术　检测通量大，可分型检测23种HPV病毒亚型，包括5种低危型(HPV6、11、42、43、44)和18种高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)，覆盖了现有已知的与宫颈癌发生有关的所有亚型，对临床动态观察和指导用药及疗效的评估有重要意义。

6.飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术　可对目前已知的所有14种高危型HPV的基因进行精确分型检测。

(三)人类免疫缺陷病毒感染

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)，为获得性免疫缺陷综合征即艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体。AIDS防治工作的一个重要组成部分为HIV感染的实验室诊断，包括血清学检测和病原学检测，前者主要是检测人体血清中的特异性抗体，后者包括病毒分离培养、病毒抗原检测、病毒核酸检测等，其中HIV核酸检测可早期发现传染源，有助于控制艾滋病的传播。我国《AIDS诊疗指南(草案)》(2004)中指出，HIV1/2抗体检测是目前HIV感染诊断的金标准，病毒载量测定和CD4+T淋巴细胞计数则是判断疾病进展、临床疗效和预后的两项重要指标。为进一步提高HIV检测的敏感度和特异度，缩短窗口期，增加确诊率，HIV分子诊断的各种新方法仍在不断开发中。

HIV的定性分子诊断主要用于HIV感染的辅助诊断。在检测血浆或血清样品时使用RT-PCR方法，在检测血细胞样品时使用两轮扩增的套式PCR方法。HIV的定性与定量分析难以截然分开，在检测血清HIV病毒时，病毒载量越高，其定性价值越大。此外，HIV的定性分子诊断还广泛应用于HIV亚型和突变耐药株的鉴定，不同亚型或突变株，其耐药性也有所差异。近年开发的一些高敏感性体细胞突变检测新技术，可对已知特定突变株进行早期监控，但由于HIV的高突变率，在很大程度上限制了未知突变包括新耐药株的早期发现，这是目前和未来一段时期内HIV分子诊断中有待解决的课题。

HIV-1的定量分子诊断即病毒载量测定常用的方法有反转录PCR扩增(RT-PCR)、分支DNA杂交扩增(bDNA)、核酸序列扩增(nucleic acid saquence-based amplification，NASBA)。3种方法的比较见表1-1。

1.RT-PCR技术　通过反转录酶使病毒RNA反转录为cDNA，随后进行多聚酶链式反应，指数扩增DNA片段，如表1-1所示Amplicor试剂盒通过将放大产物变性，然后与多孔板结合，利用酶联系统进行检测，但该法费时，约需时1d。由于RT-PCR技术可在2h内使扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平，多种改良的快速RT-PCR检测方法可实现HIV的快速临床诊断。

表1-1　3类已获FDA批准的病毒载量检测方法的比较

2.bDNA检则法　目前市场已开发的产品为bDNA定量检测血浆中HIV-1型RNA。该方法通过将捕捉到的病毒基因信号进行扩增直接检测RNA，即从HIV中提取分离RNA，与靶探针杂交抽取RNA，再通过另一部分靶探针使支链DNA分子与RNA结合，利用化学发光原理进行信号扩增，发光强度与HIV-RNA含量成比例关系。bDNA可测出单个拷贝的HIV，实际灵敏度约10000个HIV每毫升，其改良方法可达约500个HIV每毫升。但该法耗时较长，约20h。因bDNA为信号扩增系统故无扩增物的交叉污染，这是与PCR的主要区别。它可检出所有亚型，但敏感度稍低。就bDNA技术而言，使用的探针越多、核酸杂交步骤越多，其敏感性将越高，但由此所带来的非特异性结合也会增加。

3.核酸序列介导的转录性扩增　核酸序列的转录性扩增与常规PCR不同，其起始模板和最终产物均为RNA而非DNA。相应方法据其所用酶的不同而分为核酸序列扩增(NASBA)和转录介导的扩增(transcription-mediated amplification，TMA)。NASBA使用AMV反转录酶、RNA酶H和T7RNA聚合酶；TMA则仅使用MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，因MLV反转录酶已含有RNA酶H活性。反应过程包括了4个连续且不断循环的步骤：①上述酶类通过与一对特异性引物结合，完成cDNA反义链的合成；②cDNA反义链与RNA杂交，核酸分子中RNA的降解；③cDNA有义链的合成；④通过人工引物所含有的RNA聚合酶启动子序列介导的转录反应而生成RNA新生链。上述反应中1个RNA分子在1次循环中只能生成1个cDNA分子，而1个cDNA分子可转录生成100～1000个RNA分子，因而随着上述反应的不断循环进行，约90min使模板分子扩增至109倍。核酸序列介导的转录性扩增，因不需要高温循环过程，可适用于野外现场和实验室不同条件；因其高效扩增特性，既可与多孔板酶介导的显像技术结合，也可与荧光实时检测结合。对传染病病原的定性与定量检测而言，这类方法因其扩增产物的不稳定性，减少了分子诊断实验室扩增产物的交叉污染。目前，核酸序列介导的转录性扩增技术已用于HIV-1的分子诊断。

(四)SARS病毒的PCR诊断技术应用

SARS(即severe acute respiratory syndrome，严重急性呼吸性综合征)，或称非典型性肺炎，是2003年初首先在我国广东、香港暴发的严重流行性传染病。它主要由空气、病人排泄物接触等呼吸道传播途径传播。

实时荧光定量PCR技术广泛应用于SARS的早期诊断。它能快速、精确地测定病毒拷贝数，对于抗SARS药物的筛选和评价有直接的意义，通过用药前、用药后患者体内拷贝数的变化，可以客观、直接地评价药物疗效。此外，为患者康复程度和治愈与否的判断也提供了直接的治疗评价指标。