微生物鉴定的技术与方法

根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平；②细胞组分水平；③蛋白质水平；④基因组水平。

在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是20世纪60年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。

（一）经典分类鉴定法

经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4）。

图14-4 双歧法检索表例样

应用BIOLOG仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG仪上有96个小孔，其中95孔内分装有95种不同碳源的缓冲液，1孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1周，BIOLOG仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。

（二）数值分类法

数值分类法又称阿德逊氏分类法（Adansonian classification）。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50～60个，多者可达100个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵（图14-5）。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱（dendrogram）（图14-6），再结合主观上的判断（如划分类似程度大于85％者为同种，大于65％者为同属等），排列出一个个分类群。

图14-5 显示6个细菌菌株的遗传相似矩阵图

图14-6 根据相似矩阵图转换的相似关系树状谱

数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础，对于类群的划分比较客观和稳定；而且促进对细菌类群的全面考查和观察，为细菌的分类鉴定积累大量资料。但在使用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时，还应做有关菌株的DNA碱基的（G＋C）mol％和DNA杂交，以进一步加以确证。

（三）化学分类法

微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法（chemotaxonomy）。在近20多年中，采用化学和物理技术研究细菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表14-4。

表14-4 细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用

随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞壁的脂肪酸、氨基酸种类和数量现已被接受为细菌属水平的重要分类学标准。在放线菌分类中，细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。脂质是区别细菌还是古菌的标准之一，细菌具有酰基脂（脂键），而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用以确定古菌。霉菌酸的分析测定已成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标志。此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌、细胞色素，以及红外光谱等分析对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。

（四）遗传学分类法

分子遗传学分类法是以微生物的遗传型（基因型）特征为依据，判断微生物间的亲缘关系，排列出一个个的分类群。目前较常使用的方法有：

1.DNA中（G＋C）mol％分析

每一个微生物种的DNA中（G＋C）mol％的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA中（G＋C）mol％的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的（G＋C）mol％范围。DNA中（G＋C）mol％分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌DNA中（G＋C）含量的变化范围一般在25％ ～75％ ；而放线菌DNA中的（G＋C）mol比例范围非常窄（37％ ～51％）。一般认为任何两种微生物在（G＋C）含量上的差别超过了10％ ，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用（G＋C）mol％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其（G＋C）mol％含量相同或者近似，但（G＋C）mol％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相近，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的DNA的（G＋C）mol％在37～51之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的DNA碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。

2.DNA-DNA杂交

DNA杂交法的基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链DNA的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100％ 。如果两条单链DNA的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于100％ 。由此，杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的DNA杂合率可高达100％ ，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的DNA杂合率较低，约为70％ 。（G＋C） mol％的测定和DNA杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。

3.DNA-rRNA杂交

目前研究RNA碱基序列的方法有两种。一是DNA与rRNA杂交，二是16SrRNA寡核苷酸的序列分析。DNA与rRNA杂交的基本原理、实验方法同DNA杂交一样，不同的是：① DNA杂交中同位素标记的部分是DNA，而DNA与rRNA杂交中同位素标记的部分是rRNA；② DNA杂交结果用同源性百分数表示，而DNA与rRNA杂交结果用Tm（e）和RNA结合数表示。Tm（e）值是DNA与rRNA杂交物解链一半时所需要的温度。RNA结合数是100μg DNA所结合的rRNA的μg数。根据这个参数可以作出RNA相似性图。在rRNA相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用rRNA同性试验和16SrRNA寡核苷酸编目的相似性比较rRNA顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。

4.16SrRNA（16SrDNA）寡核苷酸的序列分析

首先，16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16SrRNA的相对分子质量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。

分离菌株16SrRNA基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞，加入100μL无菌重蒸H2O中，旋涡混匀后，沸水浴2min，12000r／min离心5min，上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR扩增。分离菌株16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定的一般步骤为：16S rRNA基因的PCR引物：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′；5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。扩增反应体积50μL，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行29个循环，PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行。取5μL反应液在10g·L－1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR产物测序可由专门技术公司完成。

测序得到分离菌株16SrRNA部分序列，此序列一般以* .f.seq形式保存，可以用写字板或Editsequence软件打开，将所得序列通过Blast程序与Gen Bank中核酸数据进行比对分析（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast），具体步骤如下：点击网站中Nucleotide BLAST下Nucleotide-nucleotide BLAST ［blastn］选项，将测序所得序列粘贴在“search”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“blast”，然后点击“format”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断分离菌株16SrRNA与其他相关菌株16SrRNA之间的相似性，获得鉴定结果。

遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAStar软件包中的MegAlign程序计算样本间的遗传距离。由GenBank中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入Clustalx1.8程序进行DNA同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入Phylip3.6软件包，以简约法构建系统发育树。使用Kimura2-parameter法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap）1000次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋予相同的加权值。