马铃薯脱毒苗生产技术

项目4　组织培养在现代育苗中的应用

项目描述

本项目主要以蝴蝶兰和马铃薯为例，介绍了组织培养在育苗上的应用。组织培养是现代育苗中不可缺少的一项技术，能实现种苗的扩繁和无毒苗的繁育。

学习目标

掌握蝴蝶兰组织培养育苗技术要点、马铃薯脱毒苗技术要点。

技能目标

能独立完成蝴蝶兰、马铃薯种苗的繁育工作。

案例导入

组织培养的起源

19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特提出的细胞全能性理论是植物组培的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能性的预言。

植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织—经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织—经过再分化形成组织或器官—经过培养发育成一颗完整的植株。植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫作愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整植株的学科。

任务4.1　蝴蝶兰组织培养育苗技术

知识链接

组织培养的分类

按外植体分，植物组织培养可分以下几类：

①胚胎培养 植物的胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠和子房培养，以及离体受精的胚胎培养技术等。

②器官和组织培养 器官培养是指植物某一器官的全部、部分或器官原基的培养，包括茎段、茎尖、块茎、球茎、叶片、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。组织培养有广义和狭义之分，广义上包括各种类型外植体的培养；狭义上包括形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织的培养。

③细胞培养 包括利用生物反应器进行的，旨在促进细胞生长和生物合成的大量培养系统和利用单细胞克隆技术促进细胞生长、分化直至形成完整植株的单细胞培养。

④原生质体培养 植物原生质体是被去掉细胞壁的由质膜包裹的、具有生活力的裸细胞。

蝴蝶兰，又名蝶兰，兰科多年生草本植物，属热带、亚热带气生洋兰。原产于菲律宾、印度尼西亚、马来西亚、泰国和我国台湾等地，原生种有70多种，杂交种更是数不胜数。由于花形奇特似蝶、花大，开花期长达2～3个月，花朵色彩和花纹的变化层出不穷，有白花系、红花系、粉红系、黄花系、网纹系、虎斑系、点纹系等品种系列，在热带兰中素有“兰花皇后”的美誉，观赏价值极高，以不菲的价格深受国内外花卉市场的欢迎。如2013年春节，北京花卉市场，五株一盆的蝴蝶兰，价格最低400元。

由于蝴蝶兰属单茎性气生兰，植株很少发育侧枝，很难采用常规分株方式进行繁殖；其种子也不含胚乳或其他组织，在自然条件下萌发率极低，也无法进行有性繁殖。因此，蝴蝶兰的繁殖方法一直是研究热点。1949年Rotor利用无菌培养技术成功地在试管中将蝴蝶兰花梗上的休眠芽培养出完整植株后，使组织培养方法进行种苗繁殖逐渐成为蝴蝶兰大规模生产的唯一途径。下面就从蝴蝶兰的组织培养过程、组织快繁的影响因素、栽植后管理等方面介绍蝴蝶兰工厂化育苗过程。

4.1.1　蝴蝶兰快繁的诱变途径

蝴蝶兰组培繁殖的原理是利用无菌播种或各种类型的外植体，经消毒处理后接种到初代培养基上，可诱导出类原球茎（种子萌发时先是胚的膨大，种皮破裂，一定时间后发育成肉眼可见浅黄色的原胚呈球状，称为原球茎；由其他外植体诱导产生的是一类呈珠粒状的幼嫩器官，称类原球茎）；将原球茎置于增殖的培养基中，可进行大量增殖；繁殖至一定数量后，置于分化培养基中进行分化培养，进而诱导分生苗实现快繁，就可培养出大量的植株。由于蝴蝶兰的杂合性较强，在蝴蝶兰自交或杂交后代的无菌播种后，播种苗在植株长势、叶色、花色上会有一些变异，开花整齐度不及组培苗。因此，目前蝴蝶兰组培快繁一般不选择无菌播种。

蝴蝶兰分化的另一个途径为丛生芽繁殖，对一些不易诱导类原球茎的蝴蝶兰品种是一种较好的诱导方法。该方法主要通过花梗芽诱导营养芽，然后增殖为丛生芽，置于分化培养基中进行分化培养，进而诱导分生苗实现快繁。蝴蝶兰的组织快繁按照不同的培养阶段分为诱导阶段、分化及增殖阶段、生根及壮苗、驯化及移栽4个阶段，下面就按照影响各阶段成败与否的几个关键因素来阐述蝴蝶兰组织快繁过程。

4.1.2　蝴蝶兰成苗影响因素

1）外植体的选择

Intuwong等利用蝴蝶兰的茎尖进行研究，成功获得了完整植株，茎尖一度成为蝴蝶兰快繁中主要外植体取材部位。但蝴蝶兰为单茎性植物，茎尖深存于叶片夹缝中，分离较困难，若直接从开花植株取得茎尖或茎段，易毁掉原来植株，造成浪费，因此近些年的研究中，用其他器官作为外植体逐渐代替蝴蝶兰的茎尖已成为趋势。目前，蝴蝶兰的茎尖、茎段、叶片、花梗侧芽（图4.1）、花梗节间、根尖等部位都已有培养成功的报道，方法各异，难度各有高低。其中花梗侧芽的成活率最高达75%；其次为花梗，成活率62.5%；叶片和根尖最差，分别为12.5%和7.5%。同时发现，同一外植体的不同部位对蝴蝶兰萌芽率的影响也不同，比如用花梗侧芽作为外植体，当外植体为已开花的花梗时，花梗中部腋芽的萌芽率大于上部腋芽，而上部腋芽又大于下部腋芽；当外植体为未开花的花梗时，上部腋芽的萌芽率大于中部腋芽，中部腋芽的萌芽率大于下部腋芽。针对不同外植体，取材方法也不同，通常为取材经济，常以花梗节之间1～2 cm长的幼嫩部分，切取长2～3 mm的切段作为外植体。由蝴蝶兰花梗诱导丛生芽，丛生芽增殖扩繁得到再生植株。

图4.1　花梗侧芽诱导

植物组织培养中，外植体的灭菌是组织培养成功与否的关键。为降低污染率，在蝴蝶兰栽培中可进行一些特殊处理，如不施有机肥，将盆栽兰花置于通风、透光、避雨处，避免植株及其周围介质滋生杂菌。不同灭菌方法对不同品种不同外植体的效果不同，氯化汞渗透性强，杀灭杂菌效果好，但不易彻底清洗，对外植体杀伤力强，且对环境污染严重，除非外植体来自野外或种植介质下，一般不宜使用。对来自野外生长的材料、进行特殊处理的植株地上部分外植体，一般用75%乙醇浸泡10～30 s，再用10%次氯酸钠或饱和漂白粉液并附加2～3滴吐温-80消毒，最后用无菌水冲洗4～5次，即可获得较好效果。

2）培养基的确定

基本培养基的种类是影响兰花无性繁殖的重要因素，一般在不同的培养阶段要更换4种培养基，即诱导培养基、增殖及分化培养基（图4.2）、生根培养基及壮苗培养基。蝴蝶兰组织培养采用的基本培养基有MS、1/2 MS、VW、B5、KC及其改良型等。选择培养基的原则是无机盐浓度相对较低，这已经成为人们对蝴蝶兰离体组织器官培养的共识。原球茎的诱导过程中，不同的蝴蝶兰品种和外植体对最适培养基的选择有所不同，其中以MS基本培养基最为常用，且适当减少培养基中大量元素和部分微量元素的添加量有利于原球茎的增殖，以1/2 MS对蝴蝶兰原球茎增殖效果最好。一般情况下，原球茎在基本培养基上即可增殖、分化，但在基本培养基中附加适量激素或其他添加物可显著促进原球茎的增殖与分化。

图4.2　增殖培养

3）外源激素的选择

目前，常使用的外源激素主要是生长素类（如IAA、IBA、2，4-D和NAA）和细胞分裂素类（如6-BA、ZT、KT）。蝴蝶兰组织培养中常用的细胞分裂素为6-BA，较高浓度（1～8 mg/L）的6-BA能促进蝴蝶兰原球茎增殖；较低浓度（0.1～0.5 mg/L）则能促进原球茎分化（图4.3）。

利用已过盛花期带休眠芽的花梗作为外植体材料，通过对不同配比的培养基和激素的选择，其中发现花梗腋芽最佳诱导培养基为1/2 MS＋BA 2.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，即随着BA浓度的增大蝴蝶兰花梗腋芽诱导率逐渐升高，在相同时间内，细胞分裂素增加芽诱导率也随之增加。适宜浓度的6-BA配合较低浓度的NAA，更有利于原球茎的增殖。取花梗腋芽诱导获得的无菌苗的叶片作丛生芽诱导材料、茎尖作原球茎诱导的材料，研究发现：花梗腋芽的丛生芽诱导培养基以1/2 MS＋6-BA 5 mg/L＋NAA 2 mg/L＋CM 15%培养基最合适，其中增殖仍需高浓度6-BA与低浓度的NAA混合使用。叶片诱导丛生芽以1/2 MS＋6-BA 5 mg/L＋NAA 2 mg/L＋香蕉泥10%＋AC 0.2%的培养基最宜，可见叶片丛生芽诱导仍需较高浓度的6-BA和中等浓度的NAA及香蕉泥混合使用。丛生芽增殖阶段1/2 MS＋6-BA 7mg/L＋NAA 0.5mg/L＋香蕉泥10%＋AC 0.2%培养基效果最好，可见丛生芽的增殖仍需高浓度6-BA与低浓度的NAA混合使用。

图4.3　低浓度6-BA原球茎分化

4）有机添加物

在培养基中添加特定的有机物，对改善外植体的生长状态和提高培养效率也存在一定的效果。在蝴蝶兰离体培养的培养基中常用的有机添加物主要有椰子汁、香蕉泥、土豆泥、蛋白和酵母提取物等，这些物质能为植物生长提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素，它们对细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用。新鲜椰子汁和香蕉泥是蝴蝶兰组织培养中最为常用的有机物之一，100～150 ml/L椰子汁对不定芽、体细胞胚及类球型胚的诱导、增殖有促进效果；而100～150 g/L香蕉泥对生根壮苗有很好的效果。同时，由于蝴蝶兰品种间差异较大，在组织培养中添加有机物应根据特定品种进行有选择的添加，而且应对添加物的量进行反复试验后才能确定。

5）防褐化剂

褐变是由酚类物质酶促氧化形成的醌类物质，再进一步聚合成褐色物质而产生的。褐变在植物组织培养过程中普遍存在，而在兰科植物组织培养过程中，褐变的严重发生在很大程度上制约其成功率。蝴蝶兰组织培养的褐化死亡比一般兰花严重，因而防止外植体褐化是决定蝴蝶兰组织培养成功的关键。

一般认为，一定浓度的活性炭（AC）和PVP可吸附培养过程中外植体所分泌的酚、醌类等有害物质，防止或减轻褐化，但这样会抑制蝴蝶兰外植体分化和芽的产生。通常在培养基中添加1～2 g/LAC就能达到很好的防褐变效果（图4.4），但AC浓度超过2 g/L对外植体的生长有抑制作用。

近年来发现，热激处理可以减轻褐化的发生。在采用热激处理抑制组织培养褐变的过程中发现：45℃条件下热激处理10 min，其中热激处理后立即进行接种的褐变程度最重；处理后24 h、72 h接种的，褐变程度稍轻；处理后48 h接种的褐变最轻。另外发现，培养基pH值不同培养物排出的褐变物质也不同，pH值为4.5～5.0时，培养物排出的褐变物质较多；pH值为5.4～5.5时，排出的褐变物质较少，这可能与柠檬酸抑制了多酚氧化酶的活性或增强了醌类化合物还原剂有关。

图4.4　活性炭防褐化剂

6）其他条件

蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂，对原球茎的增殖生长影响较大。蔗糖含量为2%时，原球茎分化速度最快；蔗糖含量为2%～3%时，促进芽的形成；蔗糖含量为3%～5%时，抑制原球茎的分化和生长，分化质量和分化速度都显著下降；蔗糖含量为5%时，有利于根的分化和生长。

培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，过酸或过碱都对植物材料生长有很大影响，此外琼脂培养基的pH还影响到凝固情况。原球茎在pH值5.0～5.4的环境中生长最好，丛生芽的诱导与增殖在pH值5.6～5.8的环境中生长较好。

蝴蝶兰在组织培养中，通常都以日光灯为光源，因此可以人为地控制其光照强弱。光照强度对试管苗发根和生长势均有明显的影响，光照为3 000 lx时，对蝴蝶兰根诱导和植株生长有利。在诱导蝴蝶兰丛生芽过程中，所取的花梗芽为花芽，在培养过程中，较低的温度影响（15～22℃）会使大部分花梗芽发育成花芽；在较高温度（23～26℃）下培养，花梗花芽转化为营养芽，因此在进行蝴蝶兰丛生芽诱导时的适宜温度条件为（25±2）℃。

7）生根培养

生根壮苗阶段关键在于严格筛选激素的种类和浓度，一般需降低培养基的激素含量，以便形成壮苗。常用的生长素有IBA（0.3～1.5mg/L）、NAA（0.1～0.8mg/L）。添加GA3 0.1 mg/L＋NAA 0.1 mg/L的组合能明显提高生根率，且植株健壮、长势好。蝴蝶兰属热带气生兰，具气生根，栽培上要求根部通气良好。移栽常用基质有水苔、椰糠、蛇木、树皮等，以水苔效果较好。

8）移栽和驯化

蝴蝶兰试管苗健壮与否直接影响到出瓶移栽的成活率、生长势和抗病力。健壮的试管苗，在瓶内叶片光亮且厚，不徒长，没有黄化叶，根系生长旺盛。要提高蝴蝶兰试管苗成活率，首先试管苗必须强壮。试管苗在出瓶前必须先进行炼苗，瓶苗有3片叶时，置于散射阳光处（图4.5）均匀照射20 d左右，使试管苗长得更健壮，出瓶后能更快地适应外界环境条件。

图4.5　生根苗驯化

小苗出瓶时要特别小心，先往培养瓶里注少量水，再轻轻抖动瓶子，将固体培养基抖松后，用长镊子把兰苗取出来（图4.6），尽量减少伤害兰根与兰叶。根据植株的大小，分成大小两级，在种植过程中选用相应的盆。苗株用湿水苔包根至底叶叶梢为止，小株置入120格穴盘里，大株直接种植在4 cm盆内，再放入30格穴盘中固定。

图4.6　蝴蝶兰组培苗出瓶清洗

水苔是目前蝴蝶兰种植主要的基质。水苔可塑性强，保水保肥性好，可减少肥水的使用。目前市场上销售的一般为压缩干燥水苔，使用前需进行泡水、杀菌、除酸、脱水处理。用水苔做基质应注意，随着栽培时间的增加、肥水的施用，水苔会出现酸化及腐蚀现象，且会滋生细菌。种植前，基质应先消毒，水苔不能太湿或太干，简单的方法可用手抓不出水为宜。种植时水苔不宜太紧也不宜太松，太紧不利于兰根的通透，太松兰株固定不稳和水苔吸水太多易引起烂根。水苔下部垫少量小粒碎砖块，以便通水透气；亦不能种得太深，以露出兰株茎基为宜。种苗时，水苔高度以种到营养杯从下往上数的第2条环线为好，以便日后控制肥水的量。水苔要上紧下松，即上层水苔要比下层水苔稍微紧一些，以相对减少水分蒸发，并促进根向下生长。

4.1.3　移栽后的管理

新出瓶的小苗3～5 d内给类似瓶苗的光照，晴天湿度低时需要往叶片喷一些水，但不要给根部浇水太多，否则病菌易侵入，且水分过多影响根的呼吸作用，新根发育缓慢。

移植完后，喷洒杀菌和杀虫剂，先置于光线较弱（1 000 lx以下）的温室（20～25℃），3～4周后将光线提高到正常种植的栽培光度（15 000 lx）。空气相对湿度不宜低于80%。若控制好温度和湿度，7～10 d可长出新根，两周后正常管理。在此过程中应随时清除病叶，并根据植株生长情况，及时调整水肥管理和病虫害防治。小苗用4 cm盆，4～6个月后长至中苗，换成7 cm盆（图4.7）；3～6个月后长成大苗，再换成11 cm盆；再经4～6个月的栽培，换成15 cm盆，此时可作催花处理进行商品花生产。

图4.7　蝴蝶兰换盆

4.1.4　移栽后环境调控

苗株移植后当天进行杀菌，一周内不得浇水，以减少感染病害。由于苗株根部的环境条件突然发生变化，尤其是水分供应的变化及根部受伤等因素，苗株生长暂缓，此时要注意温室内的光照、湿度、温度控制。此外，还应及时清除病叶、病苗；视苗株的生长状况，合理施用水肥和药剂防治病虫害。

1）温度

蝴蝶兰营养生长适宜的白天温度范围为25～30℃，夜间温度为18～25℃，最理想的白天温度为28℃。在适宜的温度条件下，约40 d可长出1片完整的新叶。当蝴蝶兰3.5寸苗株生长成熟后，将其置于白天温度为25～28℃、夜间温度为18～20℃的环境中，约1个月便可见到花芽萌发。温度管理应随生长阶段的不同而有所区别，幼苗时白天温度最高为28℃，夜间最低为20℃。如果温室内最高温度超过35℃，蝴蝶兰会停止生长；如果高达40℃，由于浇水灼热而出现叶片腐烂。夜间温度低于14℃，会发生寒害；低于10℃，则会发生冻害。因此，每天要根据天气情况合理使用温室的降温设施和加温设备，创造有利于苗株生长的环境温度。

2）湿度

湿度包括空气湿度和基质湿度。通常组培瓶内为高湿度的无菌环境，而温室是湿度相对较低的有菌环境，新移植的4 cm盆苗由于生长环境改变和种植时受伤等因素，很容易感病死亡。因此，刚定植的小苗必须要保证90%以上的空气湿度，以免叶片脱水。后面的生长期宜将湿度控制在60%～80%。刚定植的苗必须每天进行多次叶面喷雾，喷雾次数应视苗和天气情况而定。对于刚换盆（杯）的7 cm、11 cm盆苗，由于换盆时根部受伤，水分吸收受阻，也需要每天进行1～2次叶面喷雾。

3）光照

蝴蝶兰的光照一般以其叶片不被灼伤为限，光照越强生长越好。通常，光照控制以用手背触碰叶面不发烫为宜。刚出瓶的小苗苗株较弱，光线需控制在6 000～9 000 lx，并保持良好的通风条件；待苗株恢复稳定生长后，可以逐渐提高到15 000 lx。

4）施肥

刚出瓶的小苗在两周内不必急着浇肥，只要向其喷洒清水，每隔3～4 d喷一次2 000倍的叶面肥即可，日常养护中待水苔干后可以浇3 000～4 000倍液水肥，每浇2～3次水肥后要浇一次清水洗根。刚种植的苗可先用一次高磷肥促进根部恢复和萌发新根，日常养护中根据苗的长势，选择N、P、K比例适合的肥料施用，如“花多多”水溶性肥料。通常将不同N、P、K比例的“花多多”肥料区分如下：高P肥（N∶P∶K＝9∶45∶15）、高N肥（N∶P∶K＝30∶10∶10）、平衡肥（N∶P∶K＝20∶20∶20）、高P、K肥（N∶P∶K＝10∶30∶20）、高K肥（N∶P∶K＝15∶20∶25）。苗株催花前开始适量提高N、P肥的比例，个别地区因水质较软需要增加施用微肥。

5）病虫害防治

由于蝴蝶兰的生长环境温度高、湿度大，如通风不良易诱发病虫害，因此日常工作中要注意保持温室良好的通风透气，及时清除黄叶、病叶、病苗，并定期进行喷药预防。最好每周杀菌一次，每半个月杀虫一次。喷药最好选择晴天上午或傍晚，以免发生药害。

任务4.2　马铃薯脱毒苗生产技术

在马铃薯栽培过程中，常出现叶片皱缩卷曲、叶色浓淡不均、茎秆矮小细弱、块茎变形龟裂、产量逐年下降等现象，这表明马铃薯已经发生“退化”。种薯“退化”是病毒的侵染及其在薯块内积累造成的，这也是引起产量降低和商品性状变差的主要原因，解决这一问题的主要办法是生产脱毒种薯。只有采用现代生物技术将种薯内的病毒去掉，恢复马铃薯品种本身的生理功能和生产特性，才能防止马铃薯的“退化”，使之达到品种本身的商品性状和产量。

4.2.1　马铃薯脱毒技术

对马铃薯的脱毒目前采用最多的是“茎尖培养”脱毒技术。

1）脱毒材料的选择

首先对进行脱毒复壮的马铃薯品种或材料进行田间株选和薯块选择，不仅能提高脱毒效果，而且直接关系到经过脱毒后的材料能否应用。所选的植株必须具备典型品种特性：植株生长健壮，无明显的病毒性、真菌性、细菌性病害症状；单株产量和大薯率高；薯块无病斑、虫蛀和机械创伤。由于采用茎尖分生组织方法很难脱掉马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTV），在进行茎尖脱毒前，应先对入选的块茎进行PSTV检测，淘汰带有PSTV的薯块，以免影响脱毒效果。

2）茎尖脱毒

（1）催芽及热处理

为提高脱毒效果，脱毒材料在进行茎尖组织剥取前，应进行材料的热处理，以钝化病毒的活性，提高脱毒效果。把入选的马铃薯块茎进行打破休眠和暗光催芽处理。

（2）材料消毒

待顶芽长到2～3 cm时取下，用70%酒精浸泡30～50 s，随即用5%～7%次氯酸钠溶液灭菌20 min，然后用无菌水冲洗3～4次，用灭菌滤纸吸干材料表面水分，准备剥取茎尖。

（3）茎尖剥离培养

由于块茎萌发的芽数量有限，加上剥离过程中难免损伤到茎尖，导致可剥离的茎尖量少、成苗的机率小，易造成优良品种和材料的丢失。具体操作要点如下：

取经严格消毒过的块茎芽（1 cm长），在体视解剖镜下用手术刀等工具轻、准、快速地剥去幼叶，切取带1～2个叶原基（0.1～0.4 mm大小）的生长点，迅速接入装有茎尖分化培养基的试管或培养瓶中，注意使茎尖暴露的时间越短越好，以免超净台气流风干茎尖。每管（瓶）放一个生长点，注明品种、茎尖号、接种期。于25℃、光照12 h/d下，培养3～4周后，待芽长成含4～5片叶子的小苗时剪切成单节段，继代1～2个周期。

（4）茎尖变温处理脱病毒技术

等苗达一定数量后，转入光照培养箱内，于每天12 h光照、强度3000 lx、40℃/25℃（4 h/20 h）的变温环境中，培养3～4周后剥离茎尖。这样既能保证材料不丢失，又能增加茎尖的数量，从而能增加成苗的机率。经变温处理后的苗，在实体解剖镜下剖取带有1～2个叶原基（0.2～0.3 mm）的茎尖分生组织进行离体培养，就可得到无病毒植株。实践证明，40℃/25℃变温处理34周较37℃高温处理6～8周茎尖存活率高，而且脱病毒效果较好。

茎尖分生组织培养基：MS＋GA 0.1 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，蔗糖2%，琼脂0.7%，pH 5.8。培养条件：（23±2）℃，16 h光照，光强2 000 lx。经高温处理后，进行茎尖分生组织培养，可脱除马铃薯卷叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯杂斑病毒及马铃薯A病毒，但不能脱除马铃薯纺锤块茎类病毒。

3）病毒检测

由茎尖分生组织培养获得的试管苗，经第一次扩繁后，需对试管苗进行病毒检测。只有经病毒检测后，确认是不带病毒的株系，才能进一步利用；对带有病毒的株系，可以淘汰或进行再次脱毒。用于检测的数量不低于总数的10%，采用酶联血清检测，配合指示植物及电镜观察完成。在全世界已报道了的30多种侵染马铃薯的病毒、类病毒和类菌体中，我国只有马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯M病毒、马铃薯卷叶病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒分布广泛，危害比较严重。因此，我国对试管苗的病毒检测的重点多放在上述几种病毒上，根据检测结果出具检验结果报告单，如果脱毒苗没有检出上述病毒，应批准进行组培苗生产；不合格的脱毒苗不得用于组培快繁。继代扩繁中选留的脱毒苗，每年至少作一次病毒复检。

4.2.2　马铃薯脱毒试管苗快繁技术及管理

经病毒检测后确认不带有病毒的试管苗，在进一步大量扩繁前还需进行试种观察，检验其是否发生变异，是否符合原品种的全部生物学特性及农艺性状。淘汰变异株系，将符合原品种特征、特性的株系，进一步扩繁利用。马铃薯是一种再生能力很强的植物，对培养条件的要求不太严格，但要获得健壮的试管苗及高的增殖系数，则需对马铃薯试管苗生长的培养基、培养条件以及影响试管苗增殖系数的一些因素有个较全面的了解。

1）快繁用培养基

利用MS＋蔗糖3%＋琼脂0.7%，pH 5.8，采用不同的措施，在节约成本同时还可以使马铃薯试管苗达到壮苗目的，使其茎秆变粗、叶片变浓绿、根系变粗。关于这方面的研究报道很多，有直接用1/2 MS或用简化培养基代替MS培养基，有用自然光代替日光灯等，以及在培养基中添加矮壮素或多效唑等植物生长调节刹，对调节试管苗生长、促进壮苗都有重要作用，同时还抑制试管苗顶端优势，缩短节间距离，促进腋芽的发育，从而有效提高繁殖系数。

2）培养室环境控制

（1）污染控制

①在大量生产期间，定期（一般15～20 d）采用高锰酸钾、甲醛，关闭门窗进行熏蒸消毒，消毒后间隔1～2 d即可在室内工作；培养室外走廊或缓冲间至少2～3 d用84消毒液100倍液喷洒地面一次。

②培养室要保持干净整洁，室内每隔3 d用84消毒液100倍液喷洒地面一次，并将室内紫外灯打开消毒20 min。发现有污染的瓶苗，必须马上将其拿出，并放入高压灭菌锅灭菌，然后清洗干净备用。

（2）温度控制

一般温度应控制在20～25℃，马铃薯试管苗生长与田间植株生长一样，有一定的昼夜温差有利于苗的健壮生长。要求白天22～25℃，夜间16～20℃，高于26℃苗顶端易产生烧苗现象，高于33℃则苗停止生长。

（3）光照控制

马铃薯属喜光作物，光照越强试管苗生长越健壮。夏天昼长夜短，自然照射光多，可提高组培瓶苗移栽后的成活率。生长间的生长架以用玻璃层为宜，因利用散射光可提高组培瓶苗移栽后的成活率。光照强度4 000～6 000 lx，光照时间以每天16 h为好。

（4）湿度控制

培养室相对湿度60%比较适宜，湿度过高，特别是夏季，会导致污染率上升。

（5）培养瓶微环境控制

马铃薯是喜光和呼吸强度比较高的作物，培养容器内湿度及二氧化碳浓度直接影响试管苗的生长，可以通过瓶口覆盖物进行调节。瓶口覆盖物透气性好的如棉塞、封口膜对试管苗生长有利；而透气性差的塑料膜会使试管苗生长细弱，瓶内产生大量的气生根。

（6）脱毒苗保存与复壮

长期继代培养的试管苗有可能再次染上病毒，只有经过再次茎尖脱毒才能复壮更新，一般需两年更换一次基础苗，以提高试管苗的质量。可采取扩繁初期分出一部分苗，转入保存用培养基保存，等快繁继代两年后，用保存苗替代。保存苗培养基：MS＋甘露醇4%，蔗糖3%，琼脂0.7%，pH 5.8。而且，植物生长延缓剂对促进马铃薯试管苗缩短节间、增加茎粗、抑制徒长、促进壮苗、延长保存时间有重要作用。植物生长延缓剂的种类、浓度以及保存后对试管苗活力的影响，还需通过进一步实验来确定。此外，也可采取低温下培养，试管苗生长缓慢，减少转接次数，达到保存目的。

4.2.3　微型薯生产

生产微型薯的首要条件是防止病毒的再侵染。扦插生产微型薯是在人工隔离条件下日光温室中进行的。

1）基础苗栽培

将试管苗切成带有一个芽的茎段，转入生根培养基1/2 MS＋IAA 0.2 mg/L，白糖2%，琼脂0.7%，pH 5.8。一周后小苗长成4～5片叶及3～4条小根的健壮苗，瓶苗不打开封口膜，在温室内锻炼2 d后打开封口膜洗去根部培养基即可移栽。

（1）苗床及网室消毒

为防止病毒再度侵染，苗床需采用50～70 cm高架床。苗床用750～800倍液的代森锰锌或1%福尔马林进行消毒杀菌，消毒5 d后可投入使用。网室及周边环境选用抗蚜威或10%的吡虫啉可湿性粉剂喷施于网室中，可消灭多种传播病毒的媒介害虫。

（2）移栽苗管理

移栽苗的营养土为蛭石∶草炭∶消毒田园土＝1∶1∶1，每立方米基质加入2 kg磷酸二铵做基肥，栽植时压实苗基部并浇足定根水。移栽初期应覆盖塑料薄膜及遮阴网纱，以保持湿度及防止强光直射。散射光利于缓苗，一周后幼苗长出新根，可逐渐去掉薄膜及遮阴网纱。幼苗移栽后7～10 d期间是容易死苗的“危险期”，此阶段应保持幼苗不出现萎缩。温度、光照、水分管理原则是：晴天空气湿度小，水分蒸发量大，应及时采取补水措施；雨天或阴天则相反，需少浇或不浇；早上或傍晚浇；整个苗期前期需水量大，后期需水量少。马铃薯属喜冷凉作物，温度过高会影响幼苗健康生长及产量和质量。块茎生长最适温度15～20℃，不同品种对温度要求有所不同。夏季气温高可采用70%遮光网降低温度，防止阳光灼伤幼苗。马铃薯所需光照强度不大，幼苗期以遮阴网保证存活，后期依据品种、生长环境差异采用有效措施满足所需光照。

（3）基础苗剪切与管理

待苗长至5～8片叶时即可进行第一次剪切，以后每20 d可剪切一次。基础苗一般栽植密度5 cm×2.5 cm，即800株/m2。基础苗剪切后加强水肥管理。每次切剪后，需喷施0.1%～0.3%的营养液一次，平时每隔一天浇一次水。

2）剪切苗微型薯繁育

在基础苗上剪切苗的顶部，一般5 cm左右，带有2～3片叶。在50 mg/L吲哚丁酸中浸泡基部5 min，扦插于基质中。扦插的基质及插后苗初期管理与基础苗移栽时相同，扦插密度为10 cm×2.5 cm，400株/m2。苗成活后及时中耕除草并结合第一次培土；幼苗期不干不浇水，以利苗壮，苗长至20 cm时视苗情追肥，第二次除草培土；植株封垄前第三次培土。扦插苗长至10片叶以上时，苗基部要覆盖一次基质以利结薯，后期若有徒长现象，可喷施100 mg/L的矮壮素，以抑制生长促进块茎膨大。扦插后60 d左右可收获，每株结薯1～2个，单个重0.5 g以上，最大块茎重20 g。1 m2可收获微型薯500粒以上。

3）病虫害防治

网室内马铃薯的病害主要是晚疫病，雨季湿度大，应在叶片无水珠时及时喷药。防晚疫病可用雷多米尔500倍液喷雾，7～10 d喷一次，一般喷2～3次。虫害主要是蚜虫、潜叶蝇等。由于蚜虫可传播病毒，因此要严格防止蚜虫的发生；潜叶蝇可用20%的斑潜净微乳剂3 000倍喷雾或黄板诱杀。

4.2.4　微型薯收获

一般移植60～70 d后下部叶片枯黄便可收获，收获前一周杀秧，以利于种薯老化，避免病害侵入薯块。如此期遇到阴雨天气，应及时拔掉植株以防止病害发生，待蛭石干透后收获微型薯。收获时尽量不要弄破种皮和薯块，包装采用尼龙网袋包装，每袋2 000粒左右，装袋不超过网袋体积的2/3，平堆厚度为30 cm左右，按等级和收获期分品种装袋，做好标记，双标签，袋内袋外各一。根据当地气候，以及种薯生产量、收期、设备条件和用种季节，将种薯置于常温或低温室（平摊或上架）内避光贮存，低温贮存5～8℃，相对湿度80%～90%。

本章小结

本章主要以蝴蝶兰和马铃薯脱毒苗生产为例，介绍了组织培养在现代育苗中的应用。包括蝴蝶兰快繁途径，蝴蝶兰成苗影响因素，定植后管理及环境控制；马铃薯脱毒技术，脱毒苗快繁及微型薯生产和收获。

案　例

蝴蝶兰组培乱象频发 对产业健康发展不利

现在许多蝴蝶兰生产商买苗时都有些赌运气的成分，种苗商生产的产品质量不稳定，种苗开花后发现不是原有品种，或者长势不好、变异率很高，这些现象非常普遍。据了解，这些组培乱象以往也存在，只是当时国内组培室较少，每家的生产量不太大，矛盾没有近两年这么突出。现在随着种苗生产成倍扩张，质量把控难度大，关于种苗质量的纠纷已经到了白热化的程度。

在蝴蝶兰种植者的交流QQ群或者微博上，经常看到指名道姓的指责，说某某公司种苗的变异率竟然高达百分之六七十，或者生长非常缓慢等。但由于缺乏行业标准和仲裁机制，很难界定是种苗自身还是种植的问题，因此目前除了种植商内部消化外，很难获得合理的赔偿。

品种变异率高也导致了蝴蝶兰新品种市场寿命快速缩短。一些原本品种特性十分优异的品种，因为组培室盲目扩量导致高变异率和病毒感染等问题，性状明显退化，推出几年就遭到市场的冷遇。“富贵龙”前几年时十分受欢迎，然而组培企业大量猛切，导致第二年就退化严重，价格下滑，现在种苗商已经很少有生产这个品种的了。刚推出两年的热门品种“大辣椒”，现在也已经出现花瓣变小的趋势。新品种推出两三年就淡出市场，这对辛苦培育七八年的育种家来说是非常可悲的。

乱象背后的原因

现在业内普遍能够接受的种苗变异率是5%～8%，之所以出现百分之六七十的变异率是和增殖代数有很大关系的。“大家都知道切8到10代是相对安全的，但不少企业切到了十几甚至二十代，全然不顾客户的利益。”黄松说道。

除了增殖代数没有节制外，对品种母本筛选不够细致也是组培企业暴露出的问题。国内组培企业能自己育种、筛选品种繁育的寥寥无几，大多数都是靠购买别人的品种组培繁殖。而购买回来的新品种也需要很长时间去种植观察、筛选最优植株、了解其性状才能开始组培生产，这也需要不短的时间，非常考验组培企业掌门人的耐心。

然而，不少组培企业为了加快生产周期，不从筛选出的优质花梗切组织培养，而是直接购买母瓶进行繁殖，就无法追溯其增殖代数。陕西西安卉杉生态科技有限公司总经理甘文举告诉记者，“我们公司以前就吃过亏，现在即便是口碑再好的组培企业，我们也都不敢买母瓶进行生产。因为有可能买到的母瓶本身已经是增殖第10代的产物了，买来再组培的变异率就会直线上升。”还有的企业从未看到新品种成品花表现，只听说哪个品种好卖，直接购买2.5寸中苗就切，很难保证组培出来的种苗特性。

（来源《中国花卉报》，2012年5月23日）

案例分析与讨论题

1.哪些原因导致了组培蝴蝶兰变异率高的问题？

2.在选择组培母株时要注意哪些问题？

3.蝴蝶兰组培技术要点是什么？

复习思考题

1.蝴蝶兰快繁的诱变途径有哪些？

2.蝴蝶兰成苗的影响因素有哪些？

3.简述马铃薯脱毒技术要点。

4.马铃薯脱毒试管苗怎样快繁？