· 马铃薯在营养繁殖过程中易受病毒的侵染，当条件适合时就会在植株体内增殖、转运和积累于所结块茎中，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成50％以上的减产，严重影响到马铃薯的生产。为了解决由病毒引起的退化，采用先进茎尖组织培养生物技术，通过一定良种繁育体系，生产优质种薯，是当今世界普遍采用的保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。
宁夏西吉县马铃薯研究所
西吉县马铃薯种薯脱毒技术与应用
何建栋 杨 萍 甄继军
西吉县马铃薯脱毒种薯生产技术从1998年起，经过8年的试验研究，总结出了马铃薯茎尖组织培养脱毒技术、病毒及类病毒检测技术、试管苗切断扩繁技术、扦插快繁生产原原种技术和脱毒薯4年4级繁殖生产等5大技术体系，园区年生产马铃薯脱毒试管苗300万株，生产原原种1000万粒，年生产原种3000 t、一级种3万t，在生产上取得了显著的应用效果。
西吉县属典型的黄土高原区，海拔1980 m，土壤为黑垆土，有机质含量1.5％，年日照时数2200～2322小时，年平均气温5.3℃，≥0℃积温为2831.1℃,≥10℃活动积温为2600℃，无霜期135天，年平均降水量为427 mm，光照资源丰富，昼夜温差大，自然资源条件十分适宜马铃薯生长，地形复杂，山大沟深，隔离条件好，传毒蚜虫又不易大规模迁飞，种薯退化速度慢，具有得天独厚的自然条件、气候条件和土地资源等优势，是较为理想的种薯生产基地。自1998年我们开展“马铃薯脱毒技术研究与推广”以来，通过对马铃薯脱毒技术组装与应用，使西吉县种薯生产与自然条件优势结合，建立了脱毒种薯繁育体系，更好地发挥了自然优势。
一、脱毒种薯生产程序
采取茎尖剥离、组织培养的方法，诱导出试管苗，采用酶联免疫吸附试验法、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、指示植物方法鉴定马铃薯多种病毒及类病毒，经鉴定，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。脱毒试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在自然隔离式网室隔离条件下生产原种，用原种以后逐级生产一级种和二级种。
二、脱毒种薯生产技术
（一）茎尖剥离培养获得试管苗
经过几年的评比试验、示范和品种鉴定，选育在本地适应性广、抗性强、淀粉含量高的宁薯9号、陇薯3号、虎头等品种作为茎尖剥离培养材料。
1.单株选择。在土壤肥力中等的地块，于开花期选择生长势强，无退化表现、并具有本品种典型性状的健康植株，一般预选500～1000株，作好标记，生育后期到收获前复查1～2次，随时淘汰病株及早衰植株，收获时决选，将高产、无病并具有待选品种典型性状特征的植株块茎单收单藏。
2.块茎热处理。将入选的单株块茎在25℃条件下发芽，当芽长到0.5～1.0cm后，放置光照培养箱内，进行热处理，白天36℃持续16个小时，晚上30℃持续8个小时，处理时间为21～28天。
3.培养基制备。将制备好的茎尖组织培养基（MS+吲哚乙酸1mg/L+激动素0.05 mg/L）的培养液分装到180 mm×18 mm试管里，每管10 ml，试管用耐高温封口膜封口，在0.8 kg/cm2～1.0 kg/cm2高压灭菌锅消毒20～25分钟，直立冷却后放到超净工作台上备用。
4.外植体消毒。取热处理块茎的顶芽或侧芽长0.5～1.0 cm，放在烧杯里，盖好纱布，用自来水冲洗1小时，再移到超净工作台上，75％乙醇浸泡15～30秒，无菌水冲洗1次。然后在10％NaCl溶液或饱和漂白粉溶液中10～15分钟，取出后用无菌水冲洗2～3次，也可用0.1％升汞水浸泡8～10分钟，然后用无菌水冲洗4～5分钟。
5.茎尖剥离前消毒。无菌室、超净工作台面用75％乙醇或1％苯扎溴铵溶液（新洁尔灭）消毒，将高温灭菌的操作工具（镊子、手术剪等）和要剥离的消毒外植体放到工作台上，用紫外线灯照射20～25分钟，开启工作台风机，工作人员着清洁工作服，手用肥皂洗净，并用75％乙醇擦拭消毒。
6.茎尖剥离。在超净工作台上，将芽置于40倍双筒解剖镜下，用灭菌的解剖针去掉幼叶，直至露出半圆形光滑生长锥，剥取0.1～0.3 mm的茎尖（带1个叶原基），接种在试管中MS培养基上，每支试管中接种一个茎尖，将试管口在酒精灯外火焰上转动烘烤灭菌，封口，在管上注明品种（品系）名称，处理编号和接种日期。
7.茎尖培养与诱导。把接种好的试管放在温度25℃左右，光照强度为2000～ 3000勒克斯的培养架上培养。30～40天可看到明显伸长的茎和小叶，这时可转入普通MS培养基（不含激素和生长调节剂）的试管内培养，可获得试管苗。
（二）试管苗病毒及类病毒鉴定
马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindletuber viroid，PSTVd）是一种严重危害马铃薯生产的病害，降低产量20％～30％，防治的主要措施是应用无类病毒的种薯。由于目前还没有脱掉类病毒的有效措施，只能从未饱和侵染的群体中，采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法，鉴定筛选出未被侵染的试管苗，检测PSTV量达到ng水平。应用酶联免疫吸附技术（ELISA），采用双抗体夹心法，对试管苗带毒情况进行检测，鉴定危害马铃薯生产的6种主要病毒，即PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV。试管苗经生化鉴定后，结合指示植物如千日红、白花刺果曼陀萝、A6、洋酸浆等进行了最后鉴定，获得无类病毒、无主要病毒的试管苗为脱毒试管基础苗。由于试管苗经快繁一定时期后，病毒有可能再次侵染，所以对试管苗定期进行株系筛选，发现不好株系应立即淘汰，以保证基础苗的质量。
（三）试管苗快速繁殖
在严格消毒的情况下，采用固体、液体培养相结合的方法。在温度21℃～25℃，光照3000～4000勒克斯,日照16小时以上进行快繁基础苗。试管苗单节切段扦插在固体培养基上，经20天左右便可发育成5～10 cm高的小植株，可再进行切段繁殖。试管苗多节接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。试验表明：多节液体培养试管苗比固体培养基生根快，长得粗壮，便于栽植，同时省去大量琼脂，降低成本，提高试管苗的成活率。
1.切断扩繁前的准备工作。制备蒸馏水，清洗玻璃瓶子，配置培养基母液，MS培养基配置、灌装，并进行高压消毒。
2.无菌室消毒。用甲醛10 g/m3，高锰酸钾2 g/m3，先将高锰酸钾放在容器中，再倒甲醛，对切段室进行熏蒸。启动紫外灯，打开通风扇杀菌20分钟后，对切段室用75％的酒精喷雾，进行降尖处理。
工作人员进入无菌室时穿工作拖鞋，戴上口罩、工作帽、然后用肥皂水洗净双手，再用75％的酒精擦拭双手消毒。将干净的药用纱布用75％的酒精浸湿后擦净超净工作台面，再将苗源瓶、扩苗瓶都擦一遍。瓶子消毒结束后，打开风机及照明灯，点燃酒精灯。将浸有75％酒精中的剪刀、镊子，取出后用净纱布擦干酒精，在酒精灯外焰上烤（消毒），然后凉冷以备用。将苗源瓶在酒精灯上稍烤后取封口膜。用消毒的剪刀在苗瓶基部约0.5～1.0 cm处剪断，然后用消过毒的镊子挟出一株进行切段，切段时保证每个节段上有一个生长点，但不能有两个或两个以上的生长点，每瓶接种26～30个为宜。一瓶苗子切完后要及时消毒、封口。并注明品名、日期及操作人，然后进行第二瓶的切段，每切段一瓶之前都要注意对手、刀具进行消毒。直到一个品种或切段暂停一段时间，关掉风机同时吸灭酒精灯。将刀具插入盛有75％的酒精中浸泡，然后用干净消过毒的纱布或塑料封住盛有75％的酒精的容器，再将切段的苗瓶移至组培室。
切断小苗培育所需温度为25℃，湿度保持在75％～80％，光照2000～3000勒克斯。如果用日光灯为光源，每天光照16小时为宜，如果采用太阳散射光效果会更佳。在切段扩繁苗培育3～4天后，如果发现培养基上有红点、黑点或者切断苗根部有白色毛状物，这都是被感染的症状，应马上将感染瓶移离培养室进行高温杀菌处理。
（四）原原种（脱毒小薯）生产
1.苗床整理。将苗床整理成深0.2 m、宽1.2 m、长2 m以上的小畦，底铺一层棚膜，或沙网，然后铺上基质，厚度为6～8 cm，用清水将基质泡透，如果是育苗盘，使育苗盘中有部分水从蛭石中流出，减少蛭石盐分的积累。使基质持水达到饱和，再将基质刮平疏松并保持透气。
2.苗源培养。培养苗源有两种方法：一种是通过组织培养后，把试管苗直接带根移植到育苗盘（或苗池）中的苗；另一种是把苗子切成茎段扦插到育苗盘（或苗池）中长成的苗。试管苗移栽800株/m2为宜，移栽深度为1.5～2.0 cm，它的生长需要营养充足、高温、高湿的环境，促使其略有徒长，以利于剪切扦插，以提高扦插成活率及繁殖系数，剪过尖的基础苗必要时可以再次覆盖塑料提高苗床温度及湿度，促使腋芽萌发。增大繁育数量。
3.扦插快繁。基础苗高10 cm，7～8片叶展开、生长健壮时可进行扦插。剪苗前必须要对所用工具、工作人员进行严格消毒。其方法是：用肥皂或洗涤液剂洗手，用7％高锰酸钾对镊子、剪刀消毒，操作人员必须穿清洁工作服，室内禁止吸烟，吸烟人员禁止用手直接接触基础苗，防止植株染上花叶病毒病。剪下基础苗顶尖，带2叶1心或3叶1心为扦插小苗，将所剪的顶尖放在准备好的生根液中（20 mg/kg浓度)浸泡20分钟,按4 cm×4 cm的密度扦插在苗池中,扦插时腋芽埋在基质中，叶片露出，扦插深度为1.0～1.5 cm，扦插满一池用喷壶轻浇一遍清水,使苗子和基质充分接触,并搭小拱棚保温、保湿，遮阴培养,待6～7天生根后逐渐揭掉拱棚进行水肥管理。小拱棚未揭之前，是扦插苗缓苗阶段，主攻扦插苗生根。这时的温度保持在20℃～25℃，湿度为100％，尽可能的不浇水，以提高蛭石温度，有利于生根成活。
4.扦插苗管理。
营养液浇灌扦插苗营养液采用K5配方，一般2～3天浇一次，1.5 L/m2～2.0 L/m2，气温高、干燥时加大供水量，上午浇液，下午浇清水，阴天下雨停液。浇水和营养液最好交替进行，保持基质经常湿润。
温度管理马铃薯块茎生长的最适温度是15.6℃～18.3℃，温度高于21℃时，块茎生长迅速下降。因为种薯产量主要取决于植株干物质和光合产物向块茎的运输积累。在20℃左右同化作用达到高峰，呼吸作用很弱，有利于干物质的积累，能形成高产。茎叶生长的适温是19℃～22℃，超过25℃茎叶生长不良，30℃时，植株呼吸作用加强，同化作用形成的干物质少，所以在扦插前期的1～5周内要求温度稍高一些,到生长中、后期温度稍低一些，昼夜温差较大些，有利于块茎的形成与生长。
湿度管理未揭掉拱棚之前拱棚内的湿度应保持在95％～100％，揭掉后，湿度掌握在77％，因为基质过湿时会造成根系透气不良，甚至有病害和烂根现象，从而造成减产。
光照管理光周期对马铃薯的生长和结薯的影响是：在短日照条件下生长的植株，块茎形成比长日照条件下生长的植株早，但对于光周期的反应因品种而宜，一般晚熟品种对光周期要求严格，在长日照下延迟形成甚至不形成块茎。如果温度适宜块茎可以形成，但时间稍长些。早熟品种对光周期的要求不严格，长、短日照都能使它结薯。光照强度对马铃薯生长和结薯也有一定影响，植物的光合作用在光饱和点以下时，光照强度增加，光合作用强，产量高。在冬季，光照强度远远达不到马铃薯的光饱和点。因此，在冬季生产微型薯尽量多见日光，并增加温室和拱棚的透光性。
病虫害防治一是病害发生时，发现中心病株及时拔除或选用化学药品防治，每隔7天喷1次药，连续喷2～3次。二是防蚜，清除温室和大棚内外的杂草，严格处理作物残枝，特别是茄科作物，或用40％的乐果乳剂2000倍稀释液或用稀释3000倍的溴氰菊酯每隔7天打药防蚜。经常检查网棚有无破漏，若有及时修补，防止蚜虫侵入。网棚内生产用具不得随意拿出，严禁棚外杂草、工具等带入棚内。若连阴4天，温度在10℃左右时，要及时防治马铃薯晚疫病。
叶面追肥在苗弱时，用0.2％尿素和0.1％磷酸二氢钾及少量葡萄糖叶面喷施；在微型薯生产期若出现弱光、高温，会引起植株徒长，影响产量，可用1000 mg/ L的矮壮素喷施2～3次抑制营养生长。在种苗结薯中、后期用B9（500 mg/L）、多效唑（50 mg/L）等生长素控制茎叶的营养生长，促进块茎膨大、成熟，提高产量，缩短繁种周期。
收获与贮藏扦插苗到生长后期，薯秧逐渐变黄，停止营养液和水分供应，促进薯皮老化，进行收获。每批收获的微型薯不要混放在一起，新收获的微型薯要放在盘子或其他木板上晾一晾，不要让阳光直射，收获后最好贮存在布袋或透气的容器里带上标签，单存单贮。贮存期窖温控制在2℃～4℃，湿度控制在85％左右。
三、马铃薯脱毒种薯繁殖体系
图1 良种的繁殖体系
脱毒马铃薯的良种繁殖，我们采用“四位一体、一步到位”法，即脱毒中心生产原原种、政府采购原原种、高海拔的农户式、低海拔的网室户种植原原种、种薯公司企业收购原种的繁殖体系。同时，西吉县已建成县有中心、乡有示范村、村有示范户的推行机构，严格种薯的质量检测和全程检控，严格不同级别、不同区域的种植技术，取得了良好的效果（见图1）。
四、应用效益
马铃薯脱毒技术在宁夏西吉县种薯生产上的应用，已取得了较好的社会效益和经济效益。
首先，马铃薯脱毒技术开发运用的成功，使宁南山区脱毒马铃薯种薯生产规模逐步扩大，并向效益性规范化方向发展。西吉马铃薯科技示范园区年生产马铃薯脱毒试管苗300万株，生产原原种1000万粒，生产原种3000 t，生产一级种3万t。自1998年以来共生产推广马铃薯脱毒原原种2238.5万粒，生产原种0.51万t、一级种9.1万t，在生产上取得了显著的效果。同时，也为更新换代马铃薯品种及满足专用品种需求创造了条件。在应用外部市场中，由于宁南山区生产的种薯质量好、价格低，有很强的市场竞争力，实现了先进脱毒技术与优势地理条件相结合，使西吉县的自然优势转化为商品优势。
其次，从原种生产的效益看，产量在1.5万kg/hm2～2.3万kg/hm2，按2．00元/kg计，扣除种薯、化肥、农药、人工等费用，净增效益为9000元/hm2以上，属于高投入，高产出技术。从良种生产场效益分析，以商品薯生产作对比，净增效益是3600元/hm2，以三个体系内可控制1800 hm2生产面积计，可净增效益116.64万元。从应用种薯生产部门分析看，以宁南山区应用结果，667 m2增产30％，净增产500 kg/667m2。
总之，宁夏西吉县马铃薯脱毒技术有其先进的技术、优势的繁种条件、广阔的应用市场和显著的经济效益，马铃薯的大面积推广应用必将对当地农户的脱贫致富、新农村建设起到应有的作用。
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