细胞培养基本原理

一、组织工程学对种子细胞的要求

组织或器官的功能障碍或丧失，是人类健康面临的重要危害之一，也是人类疾病和死亡的最主要原因。目前临床上常采用自体组织移植、异体组织移植或应用人工代用品进行修复。但由于自体组织移植来源有限、必须以牺牲人体部分正常组织为代价；异体组织存在免疫排异反应及供体严重不足；人工组织代用品存在异物反应和感染等风险，均限制了其广泛临床应用。20世纪以来，随着现代医学科学技术的飞速发展，尤其是生物医学工程学、细胞生物学、分子生物学、临床医学和生物材料科学的发展，促进由多学科交叉的新兴边缘学科——组织工程学的诞生。

组织工程学（tissue　engineering）是20世纪80年代才提出的新概念，目前被正式定义为：应用生命科学与工程学原理和技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究并开发应用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物学替代的一门新兴科学。组织工程理论上是将体外分离的高浓度组织细胞，经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成、具有良好生物相容性并可被人体逐步降解、吸收的细胞支架或称细胞外基质上。然后将这种细胞生物材料复合物植入机体病损部位，生物材料在降解、吸收过程中，种植的细胞不断增生、繁殖，形成新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的，从而解决组织和器官缺损所致的功能障碍或丧失的治疗问题。组织工程的兴起，为解决目前费用昂贵的器官、组织移植和再造问题提供了崭新的方法，被认为是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学史上又一新的里程碑，也是一场意义深远的革命。

组织工程的研究内容主要集中于以下三个方面：①种子细胞的培养；②细胞外基质替代物的研究；③组织工程化组织对各种病损组织替代的研究等三方面的内容，其中获得足够数量、不引起免疫排斥反应且具有再生活力的种子细胞是开展组织工程研究的前提和基础。由于组织工程发展的最终目的是应用于临床，因此基于临床应用的实际需要，种子细胞应具有以下特点。

1．取材方便，创伤小　①取材的部位要恒定，便于规范操作；②取材方法要简单，尽量采用微创技术（如穿刺），不宜首选有一定创伤的切开取材方法，以免给患者带来更大的痛苦；③取材部位要能相对稳定地提供足够数量的目的细胞，且取材过程易于避免其他细胞造成“污染”；④取材的目标尽量小，并且对人体没有太大的生理干扰；⑤取材的组织应尽量处于稳定的体内环境，不受疾病的影响而发生质或量的改变。

2．来源丰富，使用安全　组织工程研究需要的种子细胞不仅要求取材方便，而且要求来源丰富，对机体无明显免疫排斥及潜在的疾病传播危险。组织工程有多种细胞来源，如自体细胞、同种异体及异种细胞等，自体细胞可由活检或穿刺获得的组织进行分离培养，获得所需要的功能细胞；同种异体细胞主要来自胚胎、新生儿和成体组织；异种细胞主要来自于猪、牛等动物，但每一种细胞来源都有其优缺点。由于收获来源于患者的自体细胞在体外培养扩增后再进行体内移植，不会引起免疫排斥反应和传播疾病的潜在危险，因此是最佳的细胞来源，也是目前组织工程研究中应用最为广泛的一种细胞来源。尽管如此，自体细胞作为种子细胞来源也存在明显局限性，如自体细胞来源有限，在体外传代有限，难以大量扩增，并且存在易于老化现象等，限制了其广泛应用。另一类种子细胞来源于人类或动物的异体细胞。由于人体许多组织缺乏自身细胞供应，因此，人类或动物的异体细胞作为种子细胞的另一重要来源。但利用异体细胞进行体内移植也存在明显缺陷，如容易引起病原体体内传播、免疫排斥等，因此大大降低了临床应用的安全性。细胞微囊技术为解决这些问题迈出了可喜的一步，其原理是将异体或异种细胞包裹在有免疫隔离作用的细胞微囊中，再将其植入体内，囊膜起到半透膜的作用，可以阻止细菌抗体、淋巴细胞等大分子物质通过，而氧分子、葡萄糖等细胞生存所需的营养物质及细胞分泌的激素可自由通过，让移植的细胞在免疫隔离的状态下释放具有治疗效应的物质。这一技术已成功用于治疗帕金森病和糖尿病。此外，美国Diacrin公司的科学家们通过去除或掩盖细胞表面识别“异体”细胞的蛋白质，希望获得一种“万能供体”细胞系，以克服免疫排斥反应问题，目前取得了初步成效。由于自体细胞和异体细胞作为组织工程细胞来源存在众多有待突破的限制性因素，因此，近年来，科研人员开始将注意力集中到来源丰富、使用相对安全的干细胞研究领域。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特殊细胞，根据其存在部位的不同，可分为胚胎干细胞和组织或成体干细胞两种类型。胚胎干细胞在一定的条件下可以纵向分化成为人体几乎所有的细胞类型，同时可自我复制，具有很强的繁殖能力，成体干细胞也可在特定微环境下表现出很强的跨系或跨胚层分化潜能和“可塑性”，横向分化为其他组织细胞。但存在分化潜能差、细胞来源少和存活率低等不足；胚胎干细胞数量极少，对周围环境的依赖性较强，在体外易发生分化而失去原来的特性，容易发生恶性转化而具有成瘤性。随着干细胞体外分离、培养和扩增技术取得成功、治疗性克隆干细胞技术的成熟及相关研究的进一步深入，干细胞即将成为组织工程研究的主要细胞来源。

3．种子细胞在体外具有较强的增殖能力并能定向分化　最近有报道取自体1cm2正常皮肤细胞通过组织工程学的方法经过1个月的特殊培养，可以制成相当于整个人体大小的人工皮，这显然对患者来说是一个不太能接受的等待时期。因为在此阶段中也许现有的外科技术早已能解决因组织缺损给患者带来的痛苦。如何通过改进培养装置等方法，如转壁式生物反应器来加速种子细胞在体外的扩增是一个关键问题。对于那些培养条件要求高、增殖能力低的自体细胞更需找出新方法以加速其增殖。在与材料复合时，培养液中的细胞需要适宜浓度，如2．0×107 cell／ml是软骨组织工程的最低细胞浓度，只有在细胞浓度适宜时，分布在支架中的细胞纤维构架与材料支架才能互相连接，构成完整的系统结构，保持合理的机械应力作用。同时在对组织分离、消化为细胞悬浮液过程中，只能保持原细胞数量的85%，因此，细胞提取和培养技术尚待进一步提高。另外，种子细胞植入体内后能否定向分化为预构的新生组织及进行有效的调控，也是临床所迫切需要研究解决的。

4．种子细胞植入受区后能保持修复组织的表型　人类在长期生物进化过程中不断得到优化组合，并且形成了相对稳定的体内外环境，如破坏了这种环境并且超过了一定的限度，则组织和器官就会丧失其结构和功能，例如器官结构支架，细胞及基质三者之间存在着密切的关系，破坏了这种关系，器官的功能则不能得到正常的发挥。而组织工程在体外进行细胞培养，构建组织和器官，细胞是在失神经、体液和细胞外基质条件下生长，种子细胞和材料复合后要能保持其原来的生理性状，继续分裂、增殖；而通过组织工程技术所构建的组织与宿主必然也会存在差异，当其被植入受区时，要完成对自然组织和器官的真实模拟，而且受区由于病损的原因可能失去原有的正常的环境甚至伴有炎症反应，在这样的环境下，种子细胞如何能够健康地繁殖、生长并保持其原来的生理性状也是一个亟待解决的问题。

5．种子细胞应能方便地进行基因修饰

通过分子生物学技术对种子细胞进行基因修饰，表达出期望的目的基因，改变或补充异常基因的功能，并加以指导和修复；或通过提供目的基因增加一些新的功能或是调节其他基因的活动；从而具有更丰富的基因表型促进组织的修复，调节端粒酶的活性延缓细胞的衰老，更好地满足临床应用的要求。

二、细胞培养在组织工程学中的地位和价值

细胞培养技术经过一个世纪的发展，目前已日趋成熟。体外培养的细胞具有体内细胞的大部分功能；CO2细胞孵箱、超净工作台及各种细胞培养液的存在，使人类几乎所有的细胞均可以进行体外培养，再辅以细胞的冻存与复苏技术、细胞克隆技术等，使细胞培养成为生命科学领域最重要的基础学科，同时也是组织工程学研究中最常用的研究手段。因为种子细胞是组织工程中用于修复或重建新生组织的最基本原材料，也是组织工程化组织成功构建的始动因素。利用细胞培养技术一方面可为组织工程研究提供大量的种子细胞，另一方面，利用培养的细胞可以方便地进行基因修饰，表达出期望的目的基因，促进病损组织的修复或增加组织工程化组织一些新的功能，调节端粒酶的活性延缓细胞的衰老，更好地满足临床应用的要求。此外，培养的细胞能排除神经体液因素的影响、肝肾解毒功能及其他细胞的干扰，观察某些因素或生物材料对培养细胞的直接作用，为生物材料的生物相容性检测提供便捷的方法。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程；用定时显微摄影记录可发现—些肉眼观察不到的生命现象；还可利用电镜、放射性核素标记、放免法和免疫组化法等手段来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。另外，采用细胞培养技术还可节约组织工程研究费用。由于细胞培养有可能大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时比体内试验经济得多。

当然，细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变；培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响；长期体外培养的细胞，经反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征；另外，细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。但通过改良培养技术，改进培养装置，努力创造条件以模拟体内的微环境，无疑将有利于促进细胞培养技术在组织工程学研究中发挥更加重要的作用。

总之，细胞培养技术已成为当今生命科学各研究领域的基础技术和基本技能，它又是组织工程学的重要研究手段。因此，学习细胞培养技术方法及操作要领，是从事组织工程研究的工作者必备的基本知识和技能。

三、细胞培养的基本概念

（一）细胞培养概述

细胞培养工作始于20世纪之初（Harrison　1907，Carrel　1912），现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为重要的基础科学之一。细胞培养是一种笼统的提法，严格地说，细胞培养应包括动物和植物的细胞培养。在组织工程学研究领域仅讨论动物的细胞培养，简称为细胞培养。其含义是指从动物活体内取出组织，用机械或酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。若以产生形成培养物的方法而言，可分为组织培养、细胞培养和器官培养。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块（0．5～1mm3）或薄片（厚0．2mm），而器官培养使用的是器官原基或器官的—部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动（运动）或其他变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。由于这些细胞与组织的培养物主要成分均属细胞，而这些细胞在体外生长时，仍然是相互依存、互相影响的，所以组织培养和细胞培养实际上并无本质区别。

（二）细胞培养中常用的术语

1．细胞培养（cell　cultivate）　单个细胞在体外条件下的生长，称为细胞培养。在细胞培养中，细胞不再形成组织。

2．原代培养（primary　cultivate）　从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。首次成功的传代培养之前的培养可以认为是原代培养或初代培养。

3．传代培养或传代（passage）　将细胞从一个培养容器移植到另一培养容器中培养。

4．细胞系（cell　line）　原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果细胞系不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞系（finite　cell　line）。如果可以连续传代，则称为连续细胞系（continuous　cell　line）。

5．细胞株（cell　strain）　通过筛选法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或特异性标记的细胞称为细胞株。细胞株的特性或特异性标志必须在整个培养期间始终存在，这些特性包括具有—定的标记染色体，对某种病毒的敏感性、抗性及具有的特殊抗原性等，描述一个细胞株时必须说明它的特性或标志。如果细胞株不能继续传代或传代数有限，可称为有限细胞株（finite　cell　strain）。如果可以继续传代，则可称为连续细胞株（continuous　cell　strain）。

6．亚株（substrain）　一个亚株是由某细胞株中分离出的单个细胞或群体细胞所衍生而成的。这种单个细胞或群体细胞具有的特征或标记不是亲本细胞株中所有细胞都具有的。

7．贴壁率（attachment　efficiency，seeding　efficiency）　又称接种存活率，指在—定时间内，接种细胞贴附于培养器皿表面的百分率，应当说明在测定贴壁率时的培养条件。

8．汇合（confluent）　贴壁生长的细胞在培养器皿中生长达到一定数量时细胞彼此连结成层长满器皿底壁。

9．克隆（clone）　由单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，一个克隆不一定是均质的。

10．克隆形成率（cloning　efficiency）

细胞接种到培养器皿内形成的克隆数与接种的细胞数所构成的百分率。

11．集落形成率（接种率）（plating　efficiency）　细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百分率。接种细胞的总数、培养瓶的种类以及环境条件（培养基、温度、密闭系统还是开放系统等）均须说明。该术语用以说明细胞形成纯系的百分率。

12．生长曲线（growth　curve）　以正在生长繁殖的培养物中的细胞的数目或生物量为时间的函数所绘制的曲线。

13．细胞一代时间（cell　generation time）　单个细胞连续两次分裂的间隔时间，这一时间可借助于显微电影照相术来精确测定。

14．群体密度（population　density）　培养器皿内每单位面积或体积中的细胞数。

15．群体倍增时间（population　doubling time）　在对数生长期（logarithmic　phase　of growth）计算细胞数增加一倍所需要的时间。平均群体倍增时间可以通过计算培养结束时或收集培养物时的细胞数与接种时的细胞数的比值推算而得。

16．饱和密度（saturation　density）　在特定条件下，培养器皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。在贴壁培养中以细胞数／cm2表示，在悬浮培养中则以细胞数／cm3表示。

17．体外转化（in　vitro　transformation）

培养细胞自发的或经化学致癌物、病毒、辐射等处理细胞而引起的可遗传的变化，包括形态学、抗原、肿瘤、增殖或其他特性的变化。体外恶性或肿瘤性转化只是体外转化的一种情况。在描述体外转化时应指明其转化的类型。

18．无限增殖（永生性，不死性）（immortalization）　一般用于从有限增殖的细胞转化为能无限增殖的细胞系（株）。

19．活力（viability）　在细胞培养中指细胞具有生长和代谢能力，经常以活细胞数占总细胞数的百分比来表示。

20．衰老（senescence）　在细胞培养中指细胞群体倍增到一定次数后即失去了再增殖的能力。

（南方医科大学南方医院　裴国献　任高宏）