传代细胞培养与观察

实验十四　传代细胞培养与观察

一、实验目的

（1）掌握观察体外培养细胞的形态及生长状况的方法。

（2）了解细胞的传代方法及操作。

二、实验原理

传代培养是指细胞从一个培养瓶以1∶2或1∶2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。传代培养的第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和乙二胺四乙酸盐（EDTA）所破坏。所以，一般采用胰蛋白酶和EDTA的混合物作为消化液。

三、实验用品

（1）材料：鼠肾原代细胞。

（2）器材和仪器：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌30min备用。倒置显微镜、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、记号笔、搪瓷盘、不锈钢网（100目）等。

（3）试剂：L－磷酸盐缓冲液（PBS，无钙镁溶液），0.5%胰蛋白酶，0.4% EDTA，EMEM液，3%谷氨酰胺，0.5%台盼蓝染液等。

四、实验内容

在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于倒置显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。

（1）将长成单层的原代培养细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中，酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液，然后加入适量的无钙、镁离子的PBS液，轻轻摇动，将溶液倒出。加入少许消化液（0.02%EDTA或0.04%EDTA＋0.5%胰蛋白酶液各一半），以液面盖住细胞为宜，静置5～10min。

（2）翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙（针孔大小的空隙），如出现缝隙，即可倒去消化液，加入3～5ml新鲜培养液，然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。继续轻轻地吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之即可补加营养液，进行分装。

（3）将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中，并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，做好标记，注明细胞名称、日期、培养人姓名等。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。

五、预期结果

一般情况，传代后的细胞在2h左右就能附着在培养瓶壁上，2～4d就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。

1.观察重点

细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下。

（1）首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。

（2）观察培养液颜色变化及细胞是否生长。

（3）如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征，并判断其所处的生长阶段。

（4）观察完毕，可用台盼蓝染液对细胞进行染色，以确定死、活细胞的比例。

2.细胞的生长阶段及其形态特征

传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染、培养液颜色的变化及细胞生长的情况。一般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将其分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。

（1）游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性，此时细胞多为圆形，折光率高。此期可延续数小时。

（2）吸附期（贴壁）：由于细胞的附壁特性，细胞悬液静置培养一段时间（7～8h）后，便附着在瓶壁上（此期不同细胞所需时间不同）。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点：大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。

（3）繁殖期：培养12～72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛（即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上），到细胞铺满整个瓶壁（即所谓形成细胞单层）的过程。此期细胞形态为多角形（呈现上皮样细胞的特征）。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为4级，以“＋”的多少表示如下。

“＋”：细胞占瓶壁有效面积（也就是细胞能生长的瓶壁面积）的25%以内有新生细胞。一般要观察3～5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。

“＋＋”：细胞占瓶壁有效面积的25%～75%以内有新生细胞。

“＋＋＋”：细胞占瓶壁有效面积的75%～95%，有新生细胞。细胞排列致密，但仍有空隙。

“＋＋＋＋”：细胞占瓶壁95%以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。

从“＋＋”到“＋＋＋＋”为细胞的对数增长期（或称为指数增长期）。

（4）维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。

（5）衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。