造血细胞培养检验

第五节　造血细胞培养检验

一、造血祖细胞培养检验

【原理】血液、骨髓液或脐血经过分离获得单个核细胞在适当的HGF或 HGFs作用下，在体外半固体琼脂上形成由不同成熟阶段的粒细胞和单核细胞组成的细胞集落。参与CFU-GM生长的集落刺激因子如：GM-CSF、IL-3、G-CSF、M-CSF及SCF等。每个集落可视为有一个粒、单核细胞系造血祖细胞增殖、分化而来。集落数的多少可以反应一定有核细胞数量条件下粒-单细胞水平。

【结果判断】培养7天后，将培养皿置于倒置显微镜下观察。半固体琼脂上大于40个细胞团称为集落，小于40个细胞团称为簇，一般3～5个细胞为小簇。

【参考值】

各个实验室的CFU-GM产率随条件不同有差异。BM参考值为（150±60）个/2×10⁵有核细胞，细胞簇与集落之比为5～20：1；

外周血：集落数为BM的1/10；脐血：（48±6）个/2×10⁵有核细胞。

【临床意义】

1.CFU-GM减少　常见于再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿、急性白血病、红血病、骨髓纤维化及骨髓增生异常综合征。

2.CFU-GM增加　慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症（部分患者伴白细胞增多）及缺铁性贫血部分患者。

3.CFU-GM逐渐恢复在参考范围内　再生障碍性贫血、急性白血病缓解期及慢性粒细胞性白血病缓解期。

4.CFU-GM生长特性与白血病关系　①CFU-GM在急性粒细胞性白血病中有四种生长类型：不生长型、小细胞簇型、大细胞簇型及集落型，大细胞簇型和不生长型的缓解率低。②CFU-GM在急性白血病时，细胞簇与集落之比增高，这种表现主要与急性白血病细胞释放白血病抑制物有关。

5.CFU-GM与MDS的关系　若CFU-GM的集落数降低，而细胞簇与集落之比正常者，转变为白血病的可能性降低10%，若生长型和小细胞簇型者，约为15%转化为白血病；若细胞簇与集落之比值增高以及细胞培养为大细胞簇型或无生长型者，大多数病例变成急性白血病。

二、红系祖细胞的培养

【原理】在培养体系中选择甲基纤维素做支架物，加入适量的EPO 和BPA，使骨髓中的造血细胞形成BFU-E和CFU-E。每个集落可视为一个红系祖细胞增殖分化而来，所以集落生长多少可反映所培养的造血细胞中红系祖细胞的量。BFU-E和CFU-E对EPO和BPA的敏感性及集落细胞多少的不同，培养方法也有差别。

【结果判断】CFU-E集落8～50个细胞组成的团，BFU-E集落50个以上细胞组成的团，形似烟火礼花，故称BFU-E。红系集落在倒置显微镜下的特点与粒系集落不同，与CFU-GM相比，红系集落背景稍暗、集落内细胞圆整，体积较小，因为细胞浆内有血红蛋白的合成，集落呈暗黄色，晚幼红细胞为主组成的集落表现更为明显，也可用过氧化物染色技术来鉴定Hb的存在。

【参考值】

骨髓：BFU-E集落：（25±8）个/2×10⁵有核细胞。

CFU- E集落：（140±68）个/2×10⁵有核细胞。

外周血：BFU-E集落：（26±4）个/2×10⁵有核细胞。

BFU-E集落：（76±7）个/2×10⁵有核细胞。

【临床意义】

1.BFU-E和BFU-E减少　见于再生障碍性贫血、单纯红细胞性再障、急性白血病、慢粒急变、红白血病及铁粒幼细胞性贫血。

2.CFU-ECFU-E增加　见于真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化及部分慢粒患者。

3. BFU-E和BFU-E逐渐恢复正常与白血病、MDS有关。

三、巨核系祖细胞培养

【原理】以血浆凝块或甲基纤维素为支架物，加入再生障碍性贫血患者的血清或TPO、IL-3及SCF等生长因子，使骨髓中巨核细胞系祖细胞形成CFU-MK。人CFU-MK培养仍不稳定，较多的因素影响CFU-MK的产率。

【结果判断】培养10～14天后，用倒置显微镜观察，含有3个巨核细胞以上者为CFU-MK集落，还有20～200个巨核细胞集落者称BFU-MK。CFU-MK可作为形态学及免疫化学鉴定。以血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa（CD41/ CD61）阳性为CFU-MK的标准。

【参考值】骨髓：（16.4±10.3）个/2×10⁵有核细胞。

【临床意义】

1.CFU-MK减少　常见于再生障碍性贫血、获得性无巨核细胞性血小板减少性紫癜、骨髓增生性疾病、血小板减少症和白血病。

2.CFU-MK增加　常见于慢性粒细胞性白血病、在慢粒急变时有较高的CFU-MK。

四、混合祖细胞培养

【原理】以甲基纤维素为支架物，配以各种造血因子（IL-3、GM-CSF 和EPO）PHA-LCM加EPO作为CFU-MIX刺激因子，体外受检者骨髓造血细胞可形成含有粒、红、单核及巨核细胞系的混合集落（CFU-GEMM）。

【结果判断】培养14天，用倒置显微镜观察鉴别集落，每个集落至少有50个细胞，大多为粒细胞和巨噬细胞，巨核细胞和有核红细胞数量不定。难以从形态学鉴定的CFU-GEMM，可用染色法、细胞化学及免疫荧光染色等技术来鉴定。

【参考值】国内报道，（10.8±4.9）个/2×10⁵有核细胞，在CFU-GEMM中，单纯粒、红混合集落为34.5%，含巨噬细胞者为56.3%。

【临床意义】

1.CFU-GEMM有助于调节多向祖细胞分化与增值的各种刺激因子的生物活性的定量研究。

2.CFU-GEMM产率低，临床疾病研究还较少，在生障碍性贫血CFU-GEMM减少，慢性粒细胞白血病其增值率高。

总之，造血祖细胞体外培养或克隆分析概括有以下几个作用；

1.研究造血细胞的分化成熟及调节机制。

2.各种细胞因子对造血的调节作用机制。

3.造血细胞与非造血细胞之间相互作用及调控的分子机制。

4.药物对骨髓造血的影响。

5.药物的筛选及生产。

6.造血系统疾病发生机制、诊断和疗效分析。