体外细胞培养的基本原理

组织培养指的是从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞培养用的也是同样的方法，培养物是经物理或化学方法分散获得的单个细胞或细胞群。器官培养是指从生物体内取出活的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或者组织器官的原基在体外进行培养的方法，在培养过程中仍维持着体内组织的结构特征。事实上，组织培养、细胞培养、器官培养这3种方法是没有截然界限的。以上3种培养方式都是模拟体内环境，使活体组织的结构成分在体外生长，并维持结构和功能。还有一种培养方式，即器官型培养（organotypic culture），是利用基质材料模拟相应细胞在体内的三维空间构造，培养细胞来重建组织器官的一种培养模式，也就是组织工程的体外构建。这些方法统称为体外培养技术。

细胞生存和活动依赖细胞所处的周围环境，细胞和周围环境之间存在着不断的物质交换，细胞从周围环境中获得营养物质，同时又将代谢产物释放到周围环境中。细胞的化学组分有蛋白质、核酸、糖类和脂质，还有无机盐及水分，这些化学成分有些可以从细胞的周围环境中直接获得，有些则利用周围环境所提供的原料在细胞内进行合成。

一、历史和意义

动物细胞培养技术起源于19世纪的某些胚胎学技术。1885年，德国W Roux使鸡胚髓板在温热的生理盐水中维持并存活了10d，这被认为是最初的体外组织培养实验。1887年，Arnold把白细胞收集在盛有盐水的小碟子中，并观察到这些白细胞在运动，并存活了一段时间。但由于当时的培养基不理想，因此实验很难重复，难以证明所培养的是否是真正存活的健康组织和细胞。直到1907年实验胚胎学家R Harrison借鉴前人在培养技术上的经验，将蛙胚神经管区的一小片组织接种于蛙的淋巴液中，一定时间更换用于培养的淋巴液。这片组织不但存活了几个星期，并观察到有神经突起生长，该实验不仅证明了动物组织（细胞）在离体条件下培养是完全可行的，而且也较为完善地建立了体外培养活体组织的培养体系。Harrison的研究，标志着体外培养技术的创立，标志着神经组织体外培养的开始。在此基础上，1912年Carrel不但发现鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无菌技术方面的知识引入到组织培养技术中来。他在完全没有抗生素的条件下使鸡胚心脏细胞维持连续培养数年，这充分证明动物细胞在培养条件下可以连续生长和增生。由于R Harrison和Carrel的卓越成就，细胞培养技术开始迅猛发展，并成为生物工程特别是细胞工程中一项重要的基础技术。

细胞培养的意义在于：①为细胞生物学、发育生物学、分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学等多种学科的基础研究奠定了基础，提供了重要技术手段。极大地促进了生物学和医学的发展。因为细胞培养能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动，并且可以通过染色、分子标志等手段进行摄影摄像来处理结果，较直观地观察和鉴定细胞的变化，观察手段多样，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、原子力显微镜、免疫组织化学、放射性核素标记等。②细胞培养应用广泛，可使细胞研究的种类从低等生物到高等动物，包括人类，从胚胎到成体，从正常组织到肿瘤组织，都可采用细胞培养手段进行研究。③能够部分替代动物实验，如组织工程表皮用于替代兔模型用于化妆品药物的刺激和毒性实验。④衍生了一些新的技术，如克隆技术、基因重组技术、组织工程技术。⑤模拟在体条件，进行了多种物理、化学和生物因素的影响研究。⑥更为重要的是已用于生产领域，如生产单克隆抗体、生物制品和基因工程产品等，组织工程产品是其生产特性的重要体现。

二、体外培养的基本原理

体外培养，顾名思义，就是将活体结构成分（组织、细胞或器官等）或活的个体从体内或其寄生的体内取出，放在类似体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。按照体外培养的结构成分，可以将体外培养人为地分为组织培养、细胞培养及器官培养等类别。体外培养应尽量模拟体内的生理状况，培养的环境要严格限定并精确控制。首先是必须处于无菌环境，其次要有足够的外营养和合适的底物。细胞生存和活动依赖细胞所处的周围环境，细胞和周围环境之间存在着不断的物质交换，细胞从周围环境中获得营养物质，同时又向周围环境释放代谢产物等。

（一）生存环境

首先，体外培养的细胞必须无污染及无毒。其次，影响培养的细胞生长因素还包括温度、渗透压、pH、湿度和气相等。

1．温度　适合细胞生长的温度范围很窄，适合哺乳动物细胞包括人类细胞生长的温度为35～37℃，表皮细胞的培养温度可到33℃，但是总的说来，细胞对低温的耐受要比高温强。低温可抑制细胞的代谢，通常不带来明显有害的影响，大多数细胞在接近冰点的温度仍能存活，当达到冰点时细胞活动就要相对停止。而高温则可导致酶的变性而失活，这使细胞代谢这一基本生命过程停止，从而导致细胞死亡。但是，如在培养液中加入保护剂（二甲亚砜或丙三醇），再冻存于－196℃中，能长期保存，并在解冻后能回复其生长性状。

2．pH　生物组织和细胞的正常生理功能与生化反应能够反应，都是在适当和稳定的pH环境中进行，除了少数细胞外，对多数细胞而言，培养液的pH通常为7．2～7．5。人类血液的pH是比较恒定的，经常维持在7．36～7．44。血液里有2个缓冲体系，分别为碳酸盐缓冲对（NaHCO3／H2CO3）、磷酸盐缓冲对。在体外培养条件下，培养液中的缓冲体系缓冲酸碱的功效与体内相似。

3．氧气　细胞培养需要氧气，在有氧的条件下，细胞利用葡萄糖经三羧酸循环通路生成氢离子，氢离子再经呼吸链传递，氧化成水的同时，偶联磷酸化，生成ATP，提供能量给细胞生长和合成各种成分，但浓度要适当，氧气的浓度太高，可能对细胞具有毒性。以培养皿或松开培养瓶盖子的方式的开放培养，一般常置于95%空气与5%CO2的混合气体中进行培养。

4．体液渗透压　体液渗透压来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。如溶于血浆中的晶体物质Na＋、Cl－、HCO3－等构成血浆渗透压，而血浆中的蛋白质则构成血浆胶体渗透压。正常血浆渗透压范围为280～310mmol／kg，主要由晶体渗透压组成，而胶体渗透压甚小，不超过1．5mmol／kg。当细胞膜一边的渗透压改变时，由于Na＋和K＋等离子不能自由通过细胞膜扩散，故主要靠水的转移来维持细胞内外渗透压的相对平衡。对大多数细胞来说，渗透压在260～320mmol／kg范围内都适宜。

（二）营养物质

培养细胞的营养来自培养液，培养液的详细叙述见本篇第27章。培养液中包括水、无机盐类、葡萄糖、维生素、氨基酸等。

1．水 细胞内所有的反应都离不开水，水是细胞生命的基础。人体组织的含水量与组织活力呈正相关。含水量高的组织，活力也高。首先，水是一种良好的溶剂，所有的营养物质溶解于水才利于吸收，代谢产物溶解于水才能排泄，生化反应只有在溶液状态下才能很好的进行。水具有良好的导热作用，能有效地吸收代谢过程中放出的热能，可使细胞内的温度保持稳定。细胞活动还需要依靠水的表面张力，并且表面张力对细胞形态的保持也有一定的作用。

2．无机盐类 虽然水对于生命活动是重要的，但大部分细胞不能直接耐受蒸馏水，只有在含有某些盐类的溶液中才能生存。含量较多的无机阳离子有Na＋、K＋、Ca2＋、Fe2＋、Mg2＋等，阴离子有Cl－、SO42－、PO43－、HCO3－等。这些盐类的总浓度对细胞功能活动有特殊作用。

3．葡萄糖 大部分培养基都以葡萄糖作为能量来源之一。葡萄糖的主要代谢途径是通过无氧酵解产生丙酮酸，丙酮酸可能再转变为乳酸盐和乙酰乙酸，然后进入柠檬酸循环形成CO2。培养基中乳酸的堆积在培养胚胎及转化细胞时尤为明显，这提示柠檬酸循环不能像在体一样完全进行。目前的数据表明，细胞的碳源大部分是来源于谷氨酰胺而非葡萄糖。这一发现也许可以解释某些培养的细胞对谷氨酰胺或谷氨酸盐的需求异常高的原因。

4．维生素　在细胞代谢中起调节及控制作用。维生素参与构成各种酶的活性基团，没有它们，酶就没有活性，细胞的生命也就终止了。与细胞培养有关的维生素包括脂溶性的维生素A、维生素D、维生素E及维生素K4，水溶性包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸及烟酰胺、泛酸、生物素、叶酸和维生素C等。这些维生素在很多常用限定培养基中已成为固定组成成分。

5．氨基酸　蛋白质水解产物是氨基酸，因此氨基酸是构成生命的重要成分。细胞内的20种氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸。所有细胞多需要以下12种基本氨基酸，如精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸。

（三）细胞间的相互联系

细胞不是孤立存在的，细胞之间存在着功能上和营养上的联系。激素、生长因子、神经递质、接触性抑制等都在细胞和细胞之间起作用。

1．神经递质　是神经系统胞间通讯的化学信号分子。递质的种类有胆碱类和单胺类，如乙酰胆碱、甘氨酸、去甲肾上腺素、多巴胺等。

2．激素　已证明很多激素具有促细胞生长作用。胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，对很多细胞生长均有促进作用。氢化可的松也对皮肤上皮细胞及乳腺上皮细胞有促进生长作用。生长激素、甲状腺激素、性激素等可促进细胞分裂与分化，确保各组织、器官的正常发育、成熟及生长，并影响衰老过程。

3．生长因子　EGF、FGF、NGF、PDGF、LGF（肝生长因子）等是细胞生长所需生长因子，不同的细胞对生长因子的种类和浓度的需求有区别。血清是提供生长因子和细胞其他所需物质的来源，现已从血清、各种组织和其他生物成分中，用生物工程方法制备出多种促细胞生长物并已商品化。

4．接触性抑制　细胞增生的接触性抑制是指当细胞增殖数量增多时，细胞相互接触而导致细胞运动停止。或者细胞增殖达到一定的密度后，细胞增殖停止。这些现象是细胞之间相互沟通信息的表现。

5．其他物质　在细胞生长的过程中，除需要钾、钠、钙、镁、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如铁、锌、硒等，但是在未加这些元素的情况下，细胞也能生长增殖，这可能是由于在血清中含有少量这些元素，从而得到补充的缘故。

（四）培养用液

见本篇第27章“培养用液”。

（五）培养细胞的形态学分类

体外培养的细胞，根据细胞是否能贴附生长分为贴壁型和悬浮型两大类。

1．贴壁型　大多数细胞在培养状态下需贴附于支持物才能生长，属于贴壁型细胞，贴壁后，细胞常常失去原有的特征，出现形态单一化现象，并常反映其胚层来源，其形态不能按体内标准来确定，仅大致分成4型。

（1）成纤维细胞型：凡是培养细胞的形态与Fb类似均属此型，其共同特点为胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除Fb外，心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞等由中胚层间充质起源的组织常呈本型状态。

（2）上皮型细胞：起源于内、外胚层的细胞，如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。其生长特点为呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。

（3）游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以与其他细胞相区别。

（4）多形细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。

2．悬浮型　见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。

（六）培养细胞生命期

细胞生命期指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体外培养时，组织和细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况有关系。但不论生命期长短，在细胞生存过程中，大致都经历原代培养期、传代期和衰退期3个阶段。

1．原代培养期　从体内取出组织接种培养后到第一次传代，一般持续1～4周。原代培养的细胞与体内原组织在形态和功能上相似性很大，是检测药物很好的实验对象。

2．传代期　原代细胞一经传代后就改称为细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养或传代后早期冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利生存。一般在10代内冻存，否则细胞可能失掉二倍体性质或发生转化。当传30～50代后，细胞增殖减慢，进入第三期。

3．衰退期　细胞仍然生存，但增殖慢或不增殖，最后衰退凋亡。少数情况下，由于某种因素的影响或人工诱导，细胞可能发生转化，获得永生性或恶性转化。

（七）培养细胞的一代生存期

细胞的一代，与细胞倍增含义不同，指的是从细胞接种到分离再培养的一段时间。是以传代为标志的。所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。每代细胞大概经过潜伏期、指数生长期、平台期三个阶段，整个过程呈“S”形曲线。

1．潜伏期　在细胞接种后贴壁生长以前，先经过悬浮期，即细胞在培养液中呈悬浮状态，细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，悬浮期结束，细胞贴壁。贴壁是贴壁型细胞增殖的条件之一。其影响因素很多，如支持物的种类、细胞的种类和传代次数、底物表面的电荷等，都将影响细胞的贴壁。细胞贴壁后，除先经过前述延展过程变成极性细胞外，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期，这就是潜伏期，也称延迟期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。潜伏期的长短与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。原代培养细胞潜伏期长，为24～96h或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24h；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数生长期。

2．指数生长期　指数生长期是细胞一代中活力最好、增殖最旺盛的时期，因此是进行各种实验最好和最主要的阶段。此阶段细胞分裂相增多。指数生长期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂（mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1 000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0．1%～0．5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数生长期能提供细胞系生长的重要信息，如指数期的群体倍增时间（PDT）可用于细胞对不同抑制因子或刺激性培养条件的定量研究，对连续传代也是一个良好的监测指标。一般说来，此期细胞状态比较恒定和均一，在此期末取样，产量最高，增殖能力最强。

接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5d后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。培养的正常细胞，相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。恶性肿瘤细胞由于无接触抑制，可继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，而发生密度抑制，导致细胞分裂停止。因此，细胞接触抑制和密度抑制是2个不同的概念，不应混淆。

3．平台期　平台期也称静置期、停滞期。此期细胞停止增殖。但仍有代谢活动，此时细胞需做分离培养即传代，否则随着细胞培养液中的营养逐渐耗尽，代谢产物积累，pH降低，细胞会发生中毒，表现为形态改变，甚至从底物脱落死亡。所以，在平台期应及时传代。平台期的最大细胞密度也是细胞培养中观察的重要信息。当传代后，一个新的细胞生长周期又开始了。

（八）细胞培养的转归

大部分细胞在传代后可再次增殖或传代，正常组织获得的细胞系经过多次的连续传代后，细胞会死亡，这一现象称为细胞衰老。这是由于端粒的DNA末端序列在每次细胞分裂中无法正常复制而逐渐变短造成的。但生殖细胞、干细胞和转化细胞的情况并非如此，这些细胞常通过表达能复制端粒DNA的端粒酶来延长细胞的生命，甚至具有无限增殖的能力。

1．死亡　细胞的死亡分为程序性细胞死亡和非程序性细胞死亡。

（1）程序性细胞死亡：即凋亡，是指出现染色质凝集、边缘化，细胞皱缩，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻，细胞出泡形成凋亡小体等形态学特征改变。细胞凋亡受到一系列相关基因的严格调控。

（2）非程序性细胞死亡：即坏死，是指细胞在受到环境中的物理或化学刺激时所发生的细胞被动死亡。主要的形态变化是细胞膜的破坏，细胞及细胞器水肿，但染色质不发生凝集，细胞死亡后，细胞内容物及前炎性因子释放，趋化炎性细胞浸润引起炎症，以去除有害因素及坏死细胞并进行重建。

2．去分化　去分化就是细胞失去了与成熟相关的特定表现型。这可以说是一个细胞适应的现象。与体内环境越相近，细胞愈易发生分化，细胞在体外生长时间越长，条件与体内相差越大，分化能力越差。以肝细胞为例，当肝细胞失去其特征，不能产生精氨酸酶、转氨酶等或不能分泌血清蛋白后，这些特性很难被重新诱导。去分化和去适应是不同的，后者是指特异产物可在激素、细胞与细胞相互作用、细胞与基质相互作用等调控下合成或出现和恢复其他特定功能，而且随着原来条件的恢复能重新诱导出原有性质。

3．永生化　大多数细胞有20～100代的有限生命周期，但是有些来自啮齿类动物的细胞及大多数肿瘤细胞可能产生连续的、具有无限生命周期的细胞系。这就是细胞系的永生化。在培养细胞时，细胞的有限生命周期是被一组显性衰老基因所调控，衰老基因的缺失或突变或者一个或多个肿瘤基因的过度表达或突变，都会抑制衰老基因的作用，使细胞失去细胞周期的负调节和端粒酶的再表达。现在认为永生化是多步骤过程，涉及许多细胞周期调节基因的失活，如Rb和p53。SV40LT基因的产物可以同Rb和p53结合而常被用作诱导永生化。SV40LT已被成功地用于诱导永生化成纤维细胞。应用SV40病毒从内源性启动子表达T抗原已建立了不少SV40永生化成纤维细胞。另外，腺病毒EIa、人类乳头瘤病毒（HPV）E6和E7及Epstein Barr（EBV）等均被采用作为诱导永生化，大多数可能通过抑制基因活动，阻断细胞周期进程而起作用。