病毒的细胞培养教程

细胞培养是在模拟机体内生理环境中维持细胞生长、繁殖的技术，对于病原微生物研究来说，细胞培养是进行病毒分离和鉴定的重点工具。由于病毒不具有细胞结构，所有的复制都必须依赖于特定的细胞。早期大多数病毒的分离、鉴定、致病性和中和抗体测定均需要特定的细胞。近年来，各种免疫学及分子生物学技术方法逐渐代替了细胞培养在病毒病诊断中的作用，但是细胞培养还是病毒研究中不可缺少的工具。

一、细胞培养和传代基本技术

细胞培养需要从水生动物体上获取组织，使用特定的培养液进行培养，最终获得细胞的稳定培养物，这个过程通常需要数个月以上，称为细胞的建株，获得的培养形态、特性一致的细胞称为细胞株或细胞系。细胞培养分为单层细胞培养和悬浮细胞培养两类，单层细胞培养是使细胞在培养器皿表面贴壁形成单层的培养技术。在病毒分离和培养中，一般采用单层细胞培养技术。不同的细胞株，其细胞形态、对病毒的敏感性均不相同。病毒病检测中，病毒敏感性是最重要的性状。细胞株需要在合适培养液中连续培养才能维持，这一过程称为细胞的传代。

根据培养细胞来源，细胞培养又可分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从组织消化后分散的细胞所进行的细胞培养，原代培养受动物来源及操作影响较大，结果不很稳定。在病毒分离鉴定中，一般采用已经建株的细胞株，这些细胞株培养特性及背景清楚，培养特性稳定，便于进行病毒接种和病变观察。每个细胞株有它自己的命名，常用于病毒分离鉴定的鱼类细胞株有草鱼吻端细胞ZC7901、草鱼肾细胞CIK、虹鳟性腺细胞RTG-2等。

1.培养液的配制

体外细胞生长的营养要求较为严格，细胞培养液的成分较为复杂。细胞培养一般采用商品性培养基，常用的培养基有TC-199、DMEM、L-15、L-100等。这些培养基成份稳定、且经过了毒性、生长性能检验，大大提高了工作效率。通常购买的培养基为干粉，使用时按说明书加入双蒸水溶解，由于细胞培养基的成分含有较多不稳定的营养成份，必须采取过滤灭菌方法除菌，并调节p H值，至4℃保存。培养基使用前还要加入100 IU/毫升的青链霉素以防止细胞细菌污染，此外还要加入10%的小牛血清。

2.细胞的传代技术

常用的细胞均为贴壁单层细胞，传代培养时必须使用胰酶或EDTA溶液分散贴壁细胞，使细胞从瓶壁上脱落，称为细胞的消化。细胞消化后，用吸管吹打细胞使其充分分散，然后按1∶2或1∶3的比例分装于细胞瓶，培养于适宜温度。一般可在36～48小时内长成单层细胞。

影响细胞培养成功的原因很多，如细胞瓶的清洁程度、培养液及血清批号、污染等，其中污染是造成细胞培养失败最为常见的原因。防止细胞污染，要求严格执行无菌操作步骤，所有细胞培养过程中要使用的器皿都要严格灭菌，血清购买前应对小样品进行生长和有无污染试验，操作环境、操作者及用具都应严格消毒。

3.细胞保存

细胞保存分短期保存和长期保存，短期保存是指细胞长满单层时，更换新的细胞培养液，置于比最适生长温度低5～8℃的环境，可存放1～4周，使用前一般通过两代传代培养可基本恢复细胞的正常生长状态。细胞的长期保存通常保存在-70℃或液氮中，一般可保存数年。细胞冷冻保存时需加入保护剂，以保护细胞不受损伤。冷冻细胞复苏时，要迅速解冻，离心去除保护剂，再置于细胞瓶中培养。

二、鱼类细胞培养在水生动物病毒检测中的应用

鱼类细胞培养技术与其它动物细胞培养技术基本相同，使用的培养基也源自传统的细胞培养基。不同点在于，由于鱼类是变温动物，最适生长环境为 30℃以下，因此鱼类细胞最佳温度一般为 25～30℃，这就要求用于鱼类细胞培养的培养箱必须具有升温和降温功能，以保证夏天对鱼类细胞的正常培养。不同的鱼类其培养条件大致相同，海水鱼与淡水鱼细胞渗透压有一定区别。一般培养海水鱼类时，需要在培养基中加入0.41%的Na Cl，海生爬行动物需要加入0.35%的Na Cl。牛血清的用量仍为10%～20%。

常用的鱼类细胞及病毒敏感性

三、利用鱼类细胞株分离病毒

利用细胞分离病毒基本过程大致相似，分为样品的采集、样品处理、接种细胞、出现细胞病变几个过程。细胞病变是指细胞接种病毒后产生的病理变化，又称为CPE，是病毒在细胞内增殖的体现。不同的病毒产生的细胞病变不同，常见的是细胞收缩、脱落，有些可引起细胞间相互融合形成合胞体甚至巨形细胞出现，如鱼类淋巴囊肿病病毒，有些病毒可引发细胞包涵体。不同病变也是初步判断病毒类型的重要特征。

1.样品的采集

通常选择濒死或行为异常的鱼体，采集已知或怀疑有病毒存在的部位或器官进行病毒分离。最好以活体标本送至实验室进行检测，如需运输，最好冷藏，并且要求在24小时内进行病毒检测，否则应低温冷冻保存（-20℃以下）。注意不能使用死亡已久特别是已经开始腐烂的鱼，由于大量细菌已经生长，细菌毒素会因为细胞毒性产生类似的细胞病变，影响结果的误判。

2.样品的处理和病毒分离

基本方法是将待检材料匀浆，使组织中的病毒充分释放出来。组织材料较少时，建议使用小型玻璃匀浆器。匀浆应在冰浴中进行，以防止病毒失活。一般可用磷酸缓冲液或Hanks液进行组织匀浆，再以10,000 转/分钟，高速离心，取上清液，以0.2微米或0.45微米滤器过滤除菌后，即可用于病毒的接种。

3.病毒接种

选择新长满单层的鱼类细胞，弃掉原培养液，用无血清培养液冲洗细胞1～2次，加入待测样品溶液，25～28℃吸附60分钟，以保证病毒进入细胞内，补加5～10倍样品溶液的细胞维持液（即不含小牛血清的培养液），25～28℃培养（取决于细胞培养温度）。

4.细胞病变（CPE）的观察和盲传

每天观察细胞病变，当CPE出现时，再重复接种另一批同样的细胞。应设立对照，可用正常组织同③处理作为对照，对照应当正常。如维持7天没有出现细胞病变，可将培养病毒再冻融一次，同③再接种细胞，此时由于不知道待测样品中有无病毒，因此称为盲传，通常要求盲传2～3代，重要的样品要盲传5代无病变出现可视为阴性。

5.病毒收获和观察

细胞病变出现后，一般可进一步扩增病毒。合并出现细胞病变的培养物，冻融后可合并作进一步测定。依据检测对象所具有的实验手段进一步检测病毒，可考虑采用电镜观察、抗体检测、分子生物学技术等进行病毒的检测。对于出现CPE的观察，应注意区分由于组织毒性细菌继发感染产生的毒素也会出现类似CPE的现象，区别在于毒性可随着传代而降低，而病毒随着传代而增强。另外，目前所有的鱼类细胞并不能保证对所有的鱼类病毒均敏感，出现阴性结果时应注意分析各种现象，特别是细菌分离结果以及药物治疗效果，以防止结果的误判。

四、病毒鉴定的基本方法

病毒是一类特殊的生命形式，在体外病毒以病毒颗粒的形式存在，但不表现出生命的特征，病毒进入细胞后，释放出病毒基因组，利用宿主的大分子合成系统进行病毒的复制和表达，形成新的病毒粒子。由于病毒结构简单，不具有细胞结构，病毒的分类也不同于其它生物。病毒鉴定通常采用物理、化学、生物学以及分子生物学方法。

病毒分类鉴定步骤：（1）根据病毒的宿主范围及感染表现。（2）按照病毒的理化性质，包括电镜形态、理化因子对病毒的感染性作用，鉴定核酸类型。（3）病毒的血凝特性，病毒的血清学鉴定。（4）病毒的分子生物学方法。

五、注意事项

1.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验进行前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30～60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。

2.每次操作只处理1株细胞株，不同的细胞株不要使用同一瓶培养基，避免产生细胞和病毒的交叉污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作台。

3.操作时应小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4.细胞传代培养时掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。

5.病毒感染细胞后，大多数能引起细胞病变(CPE)，有的表现为细胞从玻璃瓶壁脱落；有些使细胞溶酶体损伤，导致细胞变圆，最终细胞溶解；有些病毒的酶能使细胞膜溶解；从而使几个细胞合在一起成合胞体。细胞病变(CPE)可以直接在显微镜下观察，一般无需染色。但也有病毒不产生细胞病变，则应采用免疫荧光等技术检查细胞中的病毒。细胞感染病毒不一定是同时发生的，因此细胞病变也不一定在同一时间内出现。不同病毒产生细胞病变的时间也不尽相同，对一种病毒而言，在某种细胞培养中，其细胞病变相当稳定，因此细胞病变往往是随着病毒种类和所用细胞类型的不同而异。

习题：

1.阐述孢子虫病、小瓜虫病、固着类纤毛虫病、车轮虫病和指环虫病的组织病理特征。

2.阐述细菌性肠炎、细菌性败血症、细菌性烂鳃病、海水养殖水生动物弧菌病的组织病理特征。

3.阐述水霉病、链壶菌病和鳃霉病的组织病理特征。

4.阐述草鱼出血病、鲤春病毒血症、对虾白斑综合症、鱼类淋巴囊肿病的组织病理特征。

5.常用组织病理检测样品的固定剂？

6.电子显微镜观察检测样品固定剂？

7.什么情况下需要制备电子显微镜检测样品？

8.细菌菌种的保藏方法？

9.细菌生化鉴定的主要类型？

10.细菌自动化鉴定的局限性？

11.阐述分子生物技术在细菌鉴定中的应用？

12.真菌的培养和形态学鉴定方法？

13.真菌分离鉴定的注意事项？

14.阐述鱼类细胞培养在水生动物病毒检测中的应用。

15.常用鱼类细胞及病毒敏感性？

16.利用鱼类细胞株分离病毒的方法？

17.病毒鉴定的基本方法？

18.病毒鉴定的注意事项？