可变应力场细胞培养

应力作用促进细胞的生长和分裂增殖，这在医学中是很常见的。皮肤软组织扩张术，牵引术；骨科的肢体牵引延长术；颅颌骨牵引术等都是通过应力刺激导致细胞增殖反应的临床技术。同时，这种现象亦见于一些病理变化中，如肾小球高血压对系膜细胞的反复应力刺激而使之增生；动脉粥样硬化与作用于血管内皮组织上增大的血流剪应力的反复刺激密切相关；心肌肥大是由于压力负荷过重使心肌细胞直径增大，导致心壁厚度向内外增厚所致。近年来，应力对组织细胞的作用机制受到越来越多的研究人员的关注。随着应力场细胞培养方法的建立，应力对体外细胞培养的作用得以实施，在该领域开展了一些基础研究，并取得了初步的结果。但应力作用的详细机制仍不清楚。本节就该领域的研究方法和研究进展予以阐述。

一、应力场细胞培养方法

应力场细胞培养的基本方法是将细胞培养在特定的载体上，待其黏附生长到一定程度后将应力作用于载体，通过改变载体的变形而将应力加到细胞上，促进细胞增殖和代谢。方法的建立应满足以下要求：①易于实施；②细胞载体具有良好的生物相容性，细胞易于黏附；③载体最好为透明或半透明，以便在实验过程中用显微镜观察；④载体具有较好的弹性，应力作用取消后应能回复；⑤应力的大小应能计算，特别能计算载体的延伸率。根据细胞受力方式的不同，各类实验模型和设备不断得以发展和完善。由于体内细胞的种类繁多，每种细胞受到的应力的形式也千差万别，研究的设备和方法也不胜枚举。在此，我们仅对常见的几种方法加以介绍。

（一）流体切应力（flow　shear　stress）

流体切应力在体内主要是指由血流对血管壁施加的力。生理情况下，动脉的切应力为2Pa左右，而静脉为0．15～0．6Pa。血管内皮细胞能感受血流所施加的切应力的刺激。给细胞施加流体切应力的细胞培养方法首先是在血液流变学的研究中发展起来的。近年来在离体条件下模拟体内血液流动环境研究内皮细胞对切应力的反应及其机制已成为热点。细胞培养技术的发展及可调控切应力大小的定常流和脉动流循环装置，如平行板流体槽、圆柱形管腔式细胞培养装置等使这方面的研究成为可能。

（二）张应力（tensile　stress）

在体内，多种细胞受到的应力可以用张应力来模拟，例如心脏搏动、肌肉收缩、肌腱和韧带的拉伸、血管充盈时对管壁平滑肌细胞的牵拉、呼吸对肺泡的牵张等。给细胞施加张应力的细胞培养方法，根据应力作用的方向，可以分为单向（uniaxial）和双向（biaxial）应力；根据应力作用的频率，可分为静态（static）应力和动态（cyclic）应力；根据细胞培养载体的空间形式，可分为二维（two－dimension）和三维（three－dimension）培养，二维培养载体如弹性膜或硅胶膜，三维培养载体如弹性泡沫或纺织网。此外，利用细胞力学方法，可以在单细胞水平对细胞膜施加局部的应力，来研究膜表面离子通道的变化。

（三）压应力（compressive　stress）

使细胞在体外受到压缩应力的培养方法是采用压缩气体。但此法的一个主要缺点是气体压力增大时其溶解度增大。按照亨利定律，气体溶解度与该气体分压成正比。由于气体的溶解导致培养液中气体（尤其是O2和CO2）浓度改变影响细胞的代谢活性，因此难以确定细胞的反应是由压缩应力引起的，还是由气体浓度变化引起的。克服上述困难的方法有两个。一种是通过增加惰性气体（如氦）的分压来保证其他气体的分压不变，这样，惰性气体氦的分压增加所致的培养液中的浓度增大对细胞可能没有生物影响，而其他气体在培养液中的浓度没有变化。另一种方法是不用气体，直接用液体施加压缩应力。

此外，在单细胞水平，可以用玻璃微电极对细胞施加“触摸”（touching）应力，以研究细胞的反应。

（四）细胞表面的扭力（torsion）

这类装置的设计思想是在不改变细胞骨架的基本构型的前提下对细胞表面的受体如整合蛋白（integrin）施加极微的扭曲力。其方法是将金属微粒用特殊材料加以涂层。其表面再结合各种蛋白质，如纤维连接蛋白（fibronectin）。把这些带有涂层的金属微粒加到细胞培养液中，当细胞表面的蛋白质如整合蛋白与微粒表面的蛋白质如纤维连接蛋白结合后，利用细胞周围磁场的交互变化，通过金属微粒对细胞表面施加扭曲力。

（五）细胞产生的张力（tension）

这类细胞培养方法通常是将细胞培养在不同渗透压的培养液中，利用低渗液使细胞肿胀（swelling），利用高渗液使细胞收缩（shrink），研究细胞的受到的影响。

二、应力场对细胞结构

和功能的影响

（一）应力对细胞骨架蛋白和形态的影响

研究人员已经证实，应力能导致细胞骨架的重组进而影响细胞的形态。当切应力作用于体外培养的内皮细胞时，可使细胞变为长梭形并沿血流方向排列。在形态改变前，可见细胞骨架的改变，细胞膜内侧出现肌动蛋白纤维，细胞内形成粗而长的应力纤维（stress　fiber），并与膜附着。应力对细胞骨架蛋白和形态的影响与应力作用的强度有密切关系。随血液切应力的增加，内皮细胞中应力纤维的数量增加；鼠的骨骼肌细胞在低应变区排列方向与应力作用方向平行，而在高应变区其取向垂直于应力作用方向。血流切应力增加的区域，含应力纤维的内皮细胞增多。高血压可引起应力纤维的增加。细胞骨架和形态的改变是相辅相成的。细胞骨架的改变又可改变细胞膜的通透性和细胞生物活性物质的分泌。因此，细胞骨架的改变不仅影响细胞的形态，而且影响细胞的生物学功能。

（二）应力对细胞增殖的影响

应力引起的细胞生长，可以是直接作用，也可以通过促进生长因子或在体内促进具有生长刺激作用的激素的分泌，间接促进细胞生长。培养在明胶海绵上的胚胎大鼠的肺细胞，采用模拟胎儿呼吸运动的动态张应力（60次／min，每小时作用15min）作用48h，细胞内DNA的合成和细胞的有丝分裂都比静态培养的细胞有显著增加。研究人员还发现应力引起的肺细胞生长，主要是通过刺激生长因子的生成来介导的。研究揭示，张应力可促进肺内间质细胞产生更多的细胞外基质，包括蛋白聚糖、纤维连接蛋白、胶原纤维等。应力对细胞生长和功能的刺激，可以协调肺的生长和成熟。这种双重刺激，对于整个脏器功能的形成和完善是极其重要的。

当心肌受应力刺激时，心肌细胞内RNA和蛋白质合成增多，肌原纤维的数量增多，单个心肌细胞肥大，收缩力增强，从而维持心脏的功能。将心肌细胞培养在硅胶膜上，牵拉膜使心肌细胞受到张应力，发现细胞内的RNA和蛋白质合成增多。高血压患者长期心脏压力和容量超负荷，是心肌细胞受过大的应力刺激，其结果不仅能诱导心肌细胞的RNA和蛋白质合成增多，导致心肌体积增大与肥厚，还能使多种生长因子和激素的分泌，导致动脉内皮细胞和平滑肌细胞增殖，造成血管壁增厚。

（三）应力刺激与细胞功能

不同部位的细胞能感受不同的应力刺激，应力刺激对细胞功能的影响依刺激的种类和细胞的种类而异。在体内，某些特化的细胞对应力有直接的感受。内耳的毛细胞能感受声波的刺激，皮肤能感受触觉的刺激，而主动脉弓和颈动脉窦具有对血压变化的感受和调节功能。对于一般的细胞而言，应力刺激可导致细胞分泌生长因子等调节其功能的生物活性物质。对肺泡Ⅱ型细胞的应力刺激，可引起肺泡表面活性物质的分泌增加。

血流切应力不仅可使血管内皮细胞发生形态变化和通透性的改变，而且适当的切应力对内皮细胞功能维持是必不可少的。血流切应力能促进内皮细胞分泌多种生物活性物质，包括一氧化氮、前列环素、凝血调节蛋白和组织纤溶酶原激活物等；血流切应力还能抑制内皮细胞血管紧张素转换酶的活性，使局部的血管紧张素Ⅱ分泌减少，上述变化具有舒张血管、抑制血小板聚集、使凝血酶失活及溶解血栓的作用。切应力还可使内皮细胞低密度脂蛋白受体增多，导致细胞对低密度脂蛋白的摄取增多。

（四）应力对细胞作用的机制

细胞的增殖、分化和功能的发挥都是受基因调控的。应力对细胞功能的影响，可以在基因转录、翻译和翻译后，以及细胞及细胞间等不同水平上实现。大量研究证明，应力作用可以影响细胞内多种基因的表达。当内皮细胞受切应力作用后，有近50种细胞内基因表达的改变。心肌细胞受切应力作用后，也有多种基因表达的改变，其中多数表达增多。这些基因主要是与细胞增殖和细胞功能相关的基因。

实验证明，应力刺激引起的信号转导还影响蛋白质的翻译过程。应力刺激对蛋白质的分泌有促进作用。应力刺激对蛋白聚糖的持续性分泌有增强作用，这种作用可被与微管系统结构有关的抑制剂所阻断。应力刺激所引起的钙离子内流，是引起以微颗粒形式储存的蛋白聚糖释放的主要原因。