第六节 免疫学诊断
免疫学技术是当今生命科学实验研究的重要手段之一，临床上免疫学检测技术被广泛用于与免疫相关疾病的诊断、发病机制研究、免疫状态监测及疗效评估。随着免疫学及相关学科的进展，免疫检测技术不断发展，新方法、新技术层出不穷。本节主要介绍免疫学诊断技术的基本原理与应用。
一、抗原或抗体的检测
（一）抗原抗体反应的原理和特点
抗原上的抗原决定簇与抗体上的抗原结合部位之间具结构互补性，在适宜条件下，两者可特异性结合，出现可见反应，据此能对待检品中的抗原或抗体进行定性、定量或定位的检测。由于传统的体外抗原抗体反应多采用血清作为抗体来源，故又称血清学反应。在抗原抗体反应中，既可用已知抗体检测未知抗原，又可用已知抗原检测未知抗体。抗原抗体反应有以下特点。
1.特异性
一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，此即抗原抗体结合反应的专一性，又称特异性，它需要抗体超变区与抗原决定簇空间构型上的互补，如同钥匙和锁的关系。当两种不同的抗原物质具有相同或相似的抗原决定簇时，则抗原与抗体可发生交叉反应。
2.可见性
当抗原抗体的数量比例恰当时，在适宜的条件下，二者结合，形成肉眼可见的沉淀或凝集等现象。
3.可逆性
抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，在一定条件下可发生逆转解离。其可逆性的大小取决于抗原抗体空间构型的互补程度。互补程度越高，则亲和力越大，可逆性就越小；反之，则可逆性越大。
（二）抗原或抗体的检测方法
常用的检测方法有凝集反应、沉淀反应和免疫标记技术。
1.凝集反应
细菌、细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下形成肉眼可见的凝集团块，这一类反应称为凝集反应。
（1）直接凝集反应：指细菌或细胞等颗粒性抗原与相应抗体直接反应，出现的凝集现象（图7-7），主要有玻片法和试管法。玻片法是抗原和相应抗体在玻片上进行的凝集反应，用于定性检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定等。试管法是在试管中倍比稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原进行的凝集反应，可用于定量检测抗体，如诊断伤寒病的肥达试验。试管法凝集反应时，抗原抗体结合出现明显可见反应的最大的抗血清或抗原制剂稀释度称为效价，又称滴度。
（2）间接凝集反应：可溶性抗原与相应抗体直接反应不出现凝集现象。将可溶性抗原包被在一种与免疫无关的颗粒状载体表面形成致敏颗粒，再与相应抗体反应，则出现凝集，称为间接凝集反应。常用的载体颗粒有人O型红细胞、绵羊红细胞、乳胶颗粒等。如载体颗粒是红细胞，称为间接血凝试验；若为乳胶颗粒，则称为乳胶凝集试验。
图7-7 直接凝集反应
如果将抗体吸附到载体上，再与相应可溶性抗原反应也可出现凝集，称为反相间接血凝试验。而先将可溶性抗原与抗体反应，隔一定时间后再加入相应抗原致敏的颗粒，因抗体已与抗原结合，不再出现间接凝集现象，这种反应称为间接凝集抑制试验。
间接凝集反应具有敏感性高、快速、简便等优点，在临床上得到广泛的应用。如用乳胶凝集试验测定相关抗体，可用于辅助诊断钩体病、血吸虫病、类风湿性关节炎等。此外，用反相间接凝集试验测定抗原可做疾病早期诊断，如检测血清中的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及甲胎蛋白（AFP）等。乳胶凝集抑制试验可用于妊娠诊断。
2.沉淀反应
血清蛋白、细胞裂解液等可溶性抗原与相应抗体结合后可形成肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。沉淀反应大多以固体琼脂凝胶为介质，这种以琼脂凝胶为介质进行的沉淀反应又称琼脂扩散或免疫扩散。可溶性抗原与相应抗体在凝胶中扩散并相遇，在比例合适处结合形成可见的白色沉淀。
（1）单向琼脂扩散：将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，沉淀环的直径与抗原含量成正相关。待检标本的抗原含量可根据形成的沉淀环直径从标准曲线中查到。本方法常用于测定血清中IgG、IgM、IgA和补体C3等的含量。
（2）双向琼脂扩散：将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本方法常用于抗原或抗体的定性检测和两种抗原的相关分析。
（3）对流免疫电泳：先将待检血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中的各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，与已分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应位置形成沉淀弧。对照正常血清形成的沉淀弧数量、位置和形态，可分析标本中所含抗原成分的性质和相对含量。本方法常用于血清蛋白的种类分析（图7-8）。
（4）免疫比浊：在一定量的抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成免疫复合物。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多则浊度越高，绘制标准曲线，根据浊度推算样品的抗原含量。该法快速简便，应用范围广泛，适用于大批量标本的测定。
3.免疫标记技术
免疫标记技术是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物来反映抗原抗体反应的情况，从而间接地测出被检抗原或抗体的存在与否或量的多少。常用的标记物有荧光素、酶、放射性核素及胶体金等。免疫标记技术具有快速、定性或定量甚至定位的特点，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。
图7-8 对流免疫电泳
（1）免疫荧光法：用荧光素标记抗原或抗体，再与待检标本中的抗体或抗原反应，置于荧光显微镜下观察是否出现荧光，借此对标本中的抗原或抗体进行测定或定位。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素和藻红蛋白。免疫荧光法又分直接法和间接法（图7-9）。
①直接法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。该法的优点是特异性强，但每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。
②间接法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗（抗抗体）染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，缺点是易发生非特异性荧光干扰。
图7-9 免疫荧光法
（2）酶免疫测定（EIA）：用酶标记的抗体来检测抗原的方法。将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色，再用酶标测定仪测定光密度（OD）值以判定抗原含量。用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。该法又分酶联免疫吸附试验和免疫组化技术。
①酶联免疫吸附试验（ELISA）：酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体，其原理见图7-10。
图7-10 酶联免疫吸附试验法
②免疫组化技术：用酶标记的抗体与组织或细胞的抗原发生反应，结合形态学检查对抗原作定性、定量、定位检测的技术。
（3）放射免疫测定法（RIA）：用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫学检测的技术，常用于微量物质如胰岛素、生长激素、甲状腺素及IgE等的测定。
（4）免疫印迹法（Western blotting）：一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性及定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。
二、免疫细胞及其功能检测
（一）免疫细胞的类型与数量检测
1.E花结试验（E roestte test）
人T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体，即CD2）。在体外条件下，人T淋巴细胞能直接与绵羊红细胞结合形成花结，此试验称为E花结试验。正常情况下人外周血淋巴细胞中能形成花结的细胞（即T淋巴细胞）为60%～80%。
2.免疫荧光法
常用间接免疫荧光法检测淋巴细胞表面标志或鉴定细胞亚群。如CD3＋为T淋巴细胞，CD4＋CD8-和CD8＋CD4-为T淋巴细胞亚群，mIgD＋及mIgM＋为B淋巴细胞。正常人外周血CD3＋细胞的平均值为60%～80%，CD4＋CD8-细胞为55%～60%，CD8＋CD4-细胞为20%～30%，mIgD＋及mIgM＋为8%～12%，CD4＋/CD8＋比值为（1.7～2.0）∶1。
3.免疫磁珠分离法
将已知抗细胞表面标记的抗体包被于磁珠并与细胞悬液反应。磁珠借抗体结合于相应细胞群或亚群表面，将细胞悬液通过一个专用磁场，因磁珠被磁场吸引，使磁珠结合细胞与磁珠非结合细胞分离，以获得高纯度的CD4＋T淋巴细胞。
4.流式细胞术
流式细胞术是借助流式细胞仪（FCM）对免疫细胞及其他细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。该技术可检测T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞及其比率和CD4＋/CD8＋T淋巴细胞的比值，并可分类收集所需细胞，且能保持细胞活性以供进一步使用。
（二）免疫细胞功能测定
1.T淋巴细胞功能测定
（1）淋巴细胞转化试验：又称T淋巴细胞增殖试验。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（Con A）等丝裂原能非特异地激活培养的T淋巴细胞，使其转化为淋巴母细胞。在增殖过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质合成增加，细胞形态改变，最终细胞分裂。常用的检测方法有3 H-TdR掺入法和MTT法。此处仅介绍3 H-TdR掺入法：在外周血单核细胞（PBMC）中，加入PHA共同培养，终止培养前8～15h，加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3 H-TdR），由于3 H-TdR能掺入细胞合成的DNA中，细胞增殖水平越高，掺入的放射性核素就越多。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的β射线放射活性，以确定细胞的增殖情况。
（2）细胞毒试验：CTL、NK细胞等对靶细胞有直接杀伤作用，可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞检测，常见的检测方法如下。
①51Cr释放法：用Na251CrO4标记靶细胞，若待检效应细胞能杀伤靶细胞，则51Cr（铬）从靶细胞内释出。以γ计数仪测定释出的51 Cr放射活性，靶细胞溶解破坏越多，51Cr就释放越多，上清液的放射活性也就越高，应用公式可计算出待检效应细胞的杀伤活性。
②凋亡细胞检查法：靶细胞被细胞毒T细胞杀伤后，可发生细胞凋亡，DNA广泛断裂。将待检效应细胞和靶细胞按比例混合，培养一定时间后取培养物涂片，加入末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和其他试剂，光镜下计数凋亡细胞，可反映待检细胞的杀伤活性。
（3）皮肤试验：正常机体对某种抗原建立了细胞免疫后，如用相同的抗原做皮肤试验时，常出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应，细胞免疫功能低下者则反应微弱或为阴性。临床上可据此诊断某些病原微生物感染（结核病、麻风等）和检测细胞免疫功能在治疗过程中的变化以及判断预后，如结核菌素（OT）试验。
2.B淋巴细胞功能测定
（1）B淋巴细胞增殖试验：取人外周血分离淋巴细胞，在淋巴细胞悬液中加入含蛋白A的金黄色葡萄球菌作为B淋巴细胞刺激物（对T淋巴细胞无刺激作用）。混匀后置CO2培养箱中培养3d，结束培养前22h加入3 H-TdR，收集细胞测定掺入率并计算刺激指数以判断B淋巴细胞应答能力。
（2）抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验。将吸附有已知抗原的绵羊红细胞、待检B淋巴细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾注平皿，温育1～3h后，肉眼可见有分散的溶血空斑出现，每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数。
3.细胞因子检测
细胞因子的检测有助于了解其在免疫调节中的作用、鉴定分离淋巴细胞及监测某些疾病状态的细胞免疫功能。如根据培养的CD4＋细胞分泌的细胞因子可确定细胞亚群，产生IL-2、IFN-γ者为Th1细胞，产生IL-4、IL-10者为Th2细胞。细胞因子的检测方法如下。
（1）ELISA：用细胞因子单克隆抗体包被固相的双抗体夹心法，也可用荧光素标记抗细胞因子抗体或对胞内细胞因子染色，直接用荧光活化细胞分类器测定产生该细胞因子的细胞数目。
（2）生物活性测定法：根据细胞因子的生物学活性选用相应的检测系统，如细胞增殖法。如果选用细胞因子依赖的细胞株，则其增殖反应与细胞因子的量成正相关，根据细胞株的增殖水平可确定样品中细胞因子的含量。
（3）聚合酶链反应（PCR）：根据细胞因子的核苷酸序列，设计特定细胞因子的引物，利用逆转录PCR测定待检细胞中特异的mRNA。
小 结
免疫是机体识别和排除抗原性异物，以维持机体内环境的平衡和稳定的一种生理功能。根据免疫效应机制及其作用特征的不同，通常把免疫分为固有免疫和适应性免疫两种类型。
固有免疫是机体抵御病原体侵袭的第一道防线。适应性免疫又称为获得性免疫或特异性免疫，可分为细胞免疫和体液免疫两种类型。
超敏反应是机体对抗原物质产生异常、病理性的特异性免疫应答，但非特异性免疫也参与超敏反应发生和发展，并发挥重要作用。
Ⅰ型超敏反应主要由IgE介导，肥大细胞、嗜碱性粒细胞释放生物活性介质引起机体生理功能紊乱。Ⅱ型超敏反应由IgG、IgM介导，在补体、吞噬细胞、NK细胞参与下引起靶细胞溶解破坏。Ⅲ型超敏反应由免疫复合物沉积于血管基底膜，引起血管炎等组织损伤。Ⅳ型超敏反应由效应T淋巴细胞介导，引起以单核细胞浸润和组织损伤为主的炎症反应。各型超敏反应的发生机制不同，临床表现也不同，各有其典型的疾病。其中Ⅰ型超敏反应最常见，反应发生快，严重时可引起过敏性休克，抢救不及时可引起死亡。临床上应根据超敏反应的发生机制，采取有效的措施，积极防治超敏反应性疾病。
免疫缺陷病是由免疫系统先天发育不全或后天损害而使免疫细胞的发育、分化、增殖和代谢异常，并导致机体免疫功能降低或缺陷所表现出的临床综合征。其原因可以是免疫器官、免疫细胞、免疫分子及其信号转导的缺陷所致。根据发病原因的不同，免疫缺陷病分为原发性免疫缺陷病和继发性免疫缺陷病两大类。免疫缺陷病的临床表现复杂多样，其主要临床特征为：患者易发生反复感染，恶性肿瘤的发病率高，临床症状多变。免疫缺陷病基本治疗原则为：减少感染并及时控制感染，通过过继免疫细胞或移植免疫器官进行治疗。
自身免疫病是机体免疫系统对自身组织成分产生的免疫应答。自身免疫病实际上是由自身抗体、自身反应性T淋巴细胞或二者共同引起的针对自身抗原的超敏反应性疾病。按病变组织蔓延的范围进行分类，自身免疫病可分为器官特异性自身免疫病和全身性自身免疫病两大类。目前自身免疫病的治疗原则为：以使用免疫抑制剂，抗炎与缓解症状为主。
用人工免疫的方法可使机体获得特异性免疫，常用的制剂是疫苗、类毒素、免疫血清、人血浆球蛋白、胎盘丙种球蛋白等。减毒活疫苗在体内可持续刺激，产生持久的免疫力，效果显著优于死疫苗。预防接种的有序实施，可有效控制传染病的流行。近年来发展了许多新型的疫苗，如亚单位疫苗、合成疫苗、基因工程疫苗等。免疫调节与治疗是指通过增强或抑制机体的免疫功能，达到治疗疾病的目的。免疫检测是指利用抗原抗体特异性结合的特性，检测未知抗原或抗体的技术。这些技术的应用有助于疾病的诊断和治疗效果的判定。
能力检测
一、简答题
1.简述固有性免疫和适应性免疫的区别点。
2.简述固有性免疫的组成细胞及其功能。
3.以青霉素过敏为例，说明Ⅰ超敏反应的特点、发生机制和防治原则。
4.ABO血型不符的输血将会出现什么现象？为什么？
5.药物所致的血细胞减少症是如何发生的？
6.简述免疫缺陷病的分类、共同特点和治疗原则。
7.简述自身免疫性疾病的发病机制、类型和治疗原则。
8.简述人工自动免疫和人工被动免疫的区别及常用制剂。
9.试比较死疫苗与活疫苗的特点。
10.简述免疫治疗的常用方法。
11.试述抗原抗体反应检测的常用方法。
二、案例分析
患者，女，因“感冒伴发热、咽喉肿痛”就诊。医生诊断为急性重症感冒，给予青霉素注射3d。第1天及第2天，患者注射后无异常反应。第3天注射后，患者立即出现胸闷、气紧、面色发青、呼吸困难等症状，虽经过医院的全力抢救，最终因呼吸衰竭而死亡。
请回答下列问题：
1.请判断患者死于哪种类型的超敏反应？并说出你的判断依据。
2.此病例提示我们临床用药时应注意哪些问题？
（吾尔尼沙·玉逊）
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
