肺癌多药耐药

第四章　肺癌多药耐药

肿瘤化疗是肿瘤三大治疗方法之一，是惟一的全身性整体治疗方法。该法可治愈儿童急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、大细胞淋巴瘤及睾丸癌等;联合化疗对卵巢癌、晚期乳腺癌及小细胞肺癌虽然不能治愈，但也显示明显疗效。不幸的是肿瘤一旦复发，常常产生耐药性，从而降低了肿瘤化疗的作用。肿瘤细胞对一种化疗药物耐药的同时，对其他一些结构不同、作用机制也不同的药物也存在耐药的现象，称为多药耐药(MDR，multidrug resistance)。20世纪60年代，Kessel等最先注意到P388小鼠白血病对长春碱耐药后，对放线菌素D、柔红霉素及其他长春花碱呈交叉耐药。药物在白血病细胞内积聚减少，其降低程度与耐药程度平行。70年代，Victorlan等在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)也观察到了类似现象，并发现耐药细胞的膜糖蛋白(P-糖蛋白)过度表达，而原来的CHO敏感株无P-糖蛋白表达，且P-糖蛋白的表达程度与耐药程度呈平行关系，说明P-糖蛋白的作用是调节控制耐药细胞中的药物积聚水平。自此以后，MDR的研究迅速发展起来。

肿瘤耐药性的发生机制及如何克服耐药性，是肿瘤药理研究的重要课题之一。我国是肺癌的高发国家，近10年肺癌已占据男女恶性肿瘤发病率的第1位和第2位;并且，80%的患者确诊时已属中晚期，失去了手术的机会。因此，化疗在肺癌的治疗中发挥了重要作用。但肺癌特别是许多非小细胞肺癌患者的化疗效果不佳，或者初治效果较好，但再次治疗却很难达到理想效果。研究表明，MDR是导致肺癌化疗效果不佳或化疗失败的主要原因。因此，对MDR现象的研究一直是肺癌治疗领域的热点问题，逆转耐药性或防止耐药现象的发生有重要的理论及实际意义。关于肺癌的MDR研究主要包括以下几个方面。

一、膜糖蛋白介导的药物外排增加

(一)P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)与MDR基因

P-糖蛋白为由MDR1基因编码的存在于细胞膜上的一种相对分子质量为170 kDa的膜糖蛋白，由1 280个氨基酸组成。其分子中含有12个疏水跨膜区和2个ATP结合区，跨膜部分形成12个α螺旋。P-gp是一种能量依赖性药物排出性膜泵，它与抗癌药结合后再与ATP结合，通过ATP供能将细胞内药物泵到细胞外使药物浓度不断下降，从而导致耐药性产生。P-gp对天然的疏水性抗肿瘤药物有较强的外泵作用，包括长春碱类、蒽环类、铂类、放线菌素D及紫杉醇等，对合成药物米托蒽醌也有较强的外泵作用。MDR1基因的表达水平与肺癌耐药性和预后的关系一直是研究的重点。大多数研究表明，MDR1基因的高表达与肺癌的获得性多药耐药有关，与患者的预后密切相关。MDR1基因的过表达在非小细胞肺癌中所占比例较大，以腺癌最高，其次是鳞癌，而小细胞肺癌中接近正常组织，这与临床上腺癌对化疗不敏感而小细胞敏感的表现是一致的。肺腺癌中MDR1基因的高表达与组织分化程度有相关性，腺癌中MDR1基因的高表达主要在高分化癌，部分在中分化癌，低分化腺癌无MDR1基因的高表达。其机制可能是在化疗药物的作用下，能够高表达MDR1基因的肺癌细胞得以优势生长，或化疗药物可以直接激活肿瘤细胞中的启动子，通过调控的转录及翻译，实现MDR1基因的过表达。

(二)多药耐药相关蛋白(Multidrug Resistance Associated Protein，MRP)与基因

1992年，Cole等从耐阿霉素(ADM)的小细胞肺癌细胞株H69/AR中分离出MRP基因。其编码一种相对分子质量为190 kDa的糖蛋白即MRP蛋白，该蛋白由1 531个氨基酸组成。MRP是一种非钠依赖性需ATP供能的药物外排泵，可将细胞内药物转运至细胞外，从而使细胞内药物聚集减少;此外，MRP也可通过改变细胞内药物分布产生耐药性。在MRP过度表达的细胞中，发现蒽环类化疗药物主要聚集在细胞核周围区和胞质囊泡中，胞核内很少。而在药物敏感细胞中，药物分布有很高的核质比。MRP和P-gp的序列有15%的同源性，都是ATP结合膜转运蛋白家族的成员，两者耐药谱也相似，均为蒽环类、长春新碱、鬼臼毒素等天然化疗药。Oshika等发现，非小细胞肺癌患者中MRP表达阴性者化疗效果明显好于阳性者，认为其高表达引起的耐药性影响非小细胞肺癌患者的预后。以上研究表明，MRP的表达水平高低与肺癌对化疗药物的敏感性和预后相关。

(三)肺耐药相关蛋白(Lung resistancerelated protein，LRP)

1993年，Scheper等发现一种新的与MDR有关的蛋白质，即LRP。LRP是人类的主要穹窿蛋白，其相对分子质量为110 kDa。穹窿蛋白是一类多亚单位结构组成的细胞器，5%位于细胞核膜上参与组成核孔复合物。这种核孔复合物呈多室结构，允许分子、粒子在细胞核—质间双向转运，而穹窿则起中心活塞和运输者的作用。其余的穹窿位于胞质形成囊泡状结构，主要调节细胞内核质及穹窿内、外的物质交换。LRP耐药主要作用机制为:①参与药物的囊泡运输，将药物转入细胞的隔室，包裹在隔离微囊内而使其不能发挥作用。②药物均以DNA为靶点，LRP通过靶点屏蔽机制引起MDR。Filipits等的研究报道，LRP阳性组化疗有效率低于LRP阴性组。Berger等的实验表明，LRP阳性肺癌细胞耐药谱广，尤其对某些天然抗癌药物(如顺铂)有较强的耐药性。

二、细胞解毒系统能力增强

(一)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性增强

GST最初是从人胎盘中分离出的酸性谷胱甘肽-S-转移酶，分为α、μ、θ、π及膜结合微粒5种类型，以后发现人类肿瘤细胞的GST主要是GST-π。GST-π与恶性肿瘤的关系密切，其表达高低与肿瘤耐药呈正比。GST通过两条途径促进抗肿瘤药物从细胞中排除:①大多数抗肿瘤药物为亲电子化合物，GST催化谷胱甘肽(GSH)与亲电子化合物结合，形成GS-X复合物，然后被运送到胞外;②GST本身与亲脂性细胞毒药物结合，增加其水溶性，促进其排泄，使该药物的抗肿瘤作用下降。Bai等报道非小细胞肺癌患者癌组织中GST-π表达与含顺铂化疗方案的疗效显著相关，阳性组有效率显著低于阴性组，说明GST-π在肺癌多药耐药的产生中起重要作用。

(二)金属硫蛋白(Metallothionein，MT)增加

MT是真核细胞内主要的蛋白肽，是一种低分子量的蛋白质家族成员，存在于正常和恶性细胞的胞质和胞核中。MT可以与一系列重金属结合，形成螯合物贮存在细胞内，防止它们对膜系统、酶类及细胞内其他敏感组分的毒性作用;可以消除自由基和超氧自由基，从而在重金属解毒和维持胞内环境稳定方面起重要作用。机体环境变化及某些化疗药物(尤其是铂剂)可诱导其合成。动物肿瘤模型实验表明，使用锌盐提高小鼠瘤细胞内MT含量，肿瘤细胞对顺铂、阿霉索等药物的敏感性立即显著下降;而使用降低瘤细胞MT含量药物propargylglycine后，肿瘤细胞即恢复对这些抗癌药的敏感性。王彦等的实验结果表明，在男性肺癌患者中MT表达高于女性，鳞癌高于腺癌，提示男性肺鳞癌患者对化疗的耐药性与MT密切相关。

三、药物作用靶点减少

DNA拓扑异构酶(Topo)是DNA复制和转录所需的基本核酶，按其性质分为TopoⅠ和TopoⅡ。在真核细胞中TopoⅡ的生理功能更为重要，在DNA复制、转录、有丝分裂、染色体分离、修复中起关键作用。正常情况下，TopoⅡ在切断DNA链后即与其末端非共价结合成一暂时性易解离的Topo-DNA聚合体;当有化疗药时，化疗药可捕捉此聚合体，使其由非共价结合变成共价结合，阻止Topo-DNA聚合体解离，从而导致DNA断裂，DNA异常重组，进一步激活致死性蛋白酶表达，导致细胞死亡。若该酶含量减少，活性降低，Topo-DNA聚合体减少，则导致耐药性的产生。由TopoⅡ介导的耐药细胞无MDR基因的扩增和过量表达被称为不典型多药耐药(at-MDR)。at-MDR细胞内抗肿瘤药物的聚集量及外排无改变，但TopoⅡ活性降低。at-MDR细胞中TopoⅡ受很多因素调控，包括TopoⅡ基因调控异常、TopoⅡ基因突变、TopoⅡ同工酶改变或磷酸化，药物及细胞物理环境变化等等。目前，关于TopoⅡ所致的肺癌耐药机制还在深入的研究中。

四、核酸修复功能增强

(一)损伤修复成分l(erission repair crosscomplematingl，ERCC-1)

DNA作为多种化疗药物攻击的靶分子，其损伤修复功能异常与肿瘤耐药性的形成密切相关。在DNA损伤的切除修复过程中ERCC-1是一个关键基因，其具有损伤DNA5'的识别功能及5'－3'核酸内切酶的活性，缺失有功能ERCC-1的细胞不能修复顺铂所致的DNA损伤。Rosell等研究56例晚期非小细胞肺癌患者的ERCC-1，患者均接受标准的顺铂联合氟脱氧胞苷方案化疗。结果发现，ERCC-1高表达者化疗有效率为37.8%，显著低于低表达者的57.9%。Lord等也在56例晚期非小细胞肺癌患者中做相似研究，结果发现在所有检测的肿瘤组织中均有ERCC-1 mRNA过表达，且ERCC-1 mRNA高表达者的中位生存时间明显低于低表达者。以上研究结果均表明，ERCC-1可能与晚期非小细胞肺癌患者的化疗耐药及远期生存相关。

(二)O⁶烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(O⁶－alkylguanine－DNA alkyltransferase，AGT)

AGT能修复烷化剂类抗癌药物诱导形成的O⁶烷基鸟嘌呤DNA合成物，使肿瘤细胞产生耐药性。O⁶烷基鸟嘌呤可抑制O⁶烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶的活性，从而增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Heim等对大细胞肺癌细胞株L23及其耐顺铂细胞株进行研究，发现O⁶烷基鸟嘌呤可增强细胞株对顺铂的耐药能力，其机制可能与核酸修复过程有关，说明O⁶烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶活性的降低可能与肺癌的耐药相关。

五、凋亡与抗凋亡机制的失衡

抗癌药物能通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程而最终触发肿瘤细胞程序化死亡，导致细胞凋亡。当凋亡机制与抗凋亡机制失衡时，肿瘤细胞凋亡率明显下降，肿瘤显现出对化疗不再敏感。

(一)p53基因突变

p53是研究最广泛的抑癌基因，存在野生型(wt-p53)和突变型(mt-p53)。野生型p53具有调节细胞增殖及诱导凋亡的双重作用，能维持细胞的正常生长。当细胞遭受破坏，野生型p53就诱导DNA受损的细胞进入G₁/G₀静止期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复，若修复失败则诱导损伤的细胞凋亡。突变型p53失去了上述的细胞调节功能，使化疗药物所诱发的细胞凋亡受抑制，以致肿瘤细胞对化疗药物的耐受性显著增强;同时，突变型p53可特异性激活MDR1基因，促使Pgp表达，从而导致肿瘤细胞耐药。Rusch等对一组52例非小细胞肺癌患者进行化疗的分析显示，p53蛋白阳性患者对顺铂呈低应答。Kawasaki等的研究亦得出了相似结果。

(二)Bcl-2家族

Bcl-2家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族，可分为凋亡抑制基因(Bcl-2、Bcl-x1)和凋亡诱导基因(Bax、Bcl-xs)两大类，其中编码与耐药有关的Bcl-2位于18号染色体。由于染色体易位(18q21易位到染色体14q32)导致Bcl-2蛋白过度表达，可抑制由c-myc所诱导的细胞凋亡。更重要的是，它既能抑制依赖p53的凋亡途径又能抑制非依赖p53的凋亡途径，从而显著延长细胞生长期，使肿瘤表现出耐药性。Bax基因和Bcl-2基因是一对正负凋亡调节基因，其功能与Bcl-2相反。Bax蛋白是Bcl-2蛋白重要抑制因子，Bax和Bcl-2可形成异二聚体，从而抑制Bcl-2的功能。当Bax蛋白或Bax蛋白二聚体占优势时，细胞凋亡可被诱导;当Bcl-2蛋白和Bcl-2蛋白二聚体占优势时，细胞凋亡被抑制。目前，随着对Bcl-2家族研究的深入，已证实其在肺癌患者的耐药性中起着重要的作用，Bcl-2的高表达及Bax表达降低是肺癌患者对化疗药物产生耐药的一个重要原因。

(三)PTEN基因

PTEN基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten)位于染色体10q23.3，由9个外显子和8个内含子组成，含1 209个核苷酸，编码403个氨基酸组成的蛋白质，具有磷酸酶活性，可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶活性来抑制肿瘤的发生发展，是近几年研究较多的一种抑癌基因。PTEN基因异常可存在于多种肿瘤，与肿瘤发生关系密切，其失活主要通过等位基因缺失、突变、甲基化方式。有报道，PTEN基因能增加肿瘤细胞对细胞毒化疗药的敏感性，诱导凋亡，抑制拓扑异构酶的活性。Saga等发现，转染有PTEN基因的SHIN-3卵巢癌细胞对SN-38有高度敏感性，从而证明高表达的PTEN能增加卵巢癌细胞对喜树碱类化疗药的敏感性。Sofia等用免疫组化法和甲基化特异性PCR法检测125例非小细胞肺癌组织标本中PTEN的表达和甲基化状况。结果发现，24%的患者PTEN无表达，在35%的PTEN阴性标本有PTEN甲基化，可见非小细胞肺癌患者对喜树碱类化疗药的耐药与PTEN基因的失活密切相关。

(四)凋亡抑制因子survivin

survivin是至今发现最强的凋亡抑制因子，定位于17q25，靠近端粒，含有4个外显子和3个内含子，编码142个氨基酸、相对分子质量为16.5 kDa的蛋白质。survivin编码的蛋白属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能。研究表明，survivin可抑制Caspase、Bax、某些化疗药物、IL-3、TNF-α、X射线等多种凋亡刺激因子引起的凋亡。Falleni等应用RT-PCR及免疫组化法对83例Ⅰ期非小细胞癌标本进行检测，发现96%的标本出现survivin mRNA的高表达，与正常肺组织相比差异有显著性。Olie等用最佳反义寡核苷酸序列4003转染A549肺腺癌细胞后可使survivin mRNA水平下降30%，细胞生长受到抑制并直接诱导凋亡;同时，肿瘤细胞对化疗的敏感性也提高了6倍，而不表达survivin的正常细胞却不受影响，说明survivin的表达与肺癌耐药有一定的相关性。

六、其他耐药机制

(一)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介导的MDR

PKC是一种钙离子、磷脂依赖，需二乙酰甘油(DAG)活化的激酶，是由一个超基因家族编码同源性很高的相关分子组成的一组酶，已发现7种不同形式的异构体，在细胞的跨膜信号和调节细胞生长分化中有广泛的作用。目前，许多研究表明PKC在MDR的发生发展中起重要作用。PKC可在转染细胞中稳定表达并呈现MDR表型。通过药物选择法获得的MDR细胞株常伴有PKC含量和活性增高，均表明PKC与MDR的相关性。有关PKC参与MDR的作用机制可能是参与了膜蛋白磷酸化，PKC可以参与调节P-gp磷酸化程序，提高P-gp生物活性。PKC家族在MDR发生发展中的作用是可以肯定的，但其在肺癌耐药中的机制尚有待于进一步研究。

(二)β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)与MDR

β-微管蛋白是很多化疗药物作用的靶点之一，其表达与化疗耐药的关系也是目前研究的热点。β-tubulin的基因定位于6p21.3，有4个外显子。第4外显子是最重要的，不仅是主要编码区，而且是β-tubulin与GTP和紫杉类药物作用的位点，经常发生突变。β-tubulin有7种异构体，Verdier Pinard等用等电点聚焦和质谱仪联合检测发现，在7种异构体中β-tubulinⅢ与微管作用药物的耐药关系最为密切。Haft等将β-tubulinⅢcDNA转染至哺乳动物细胞系，表达有β-tubulinⅢ蛋白的细胞显示出对紫杉醇耐药。Rosell等用定量PCR法检测75例非小细胞肺癌石蜡组织中β-tubulinⅢmRNA的表达。研究发现，低β-tubulinⅢ表达者对紫杉醇敏感性高，疗效好，说明β-tubulinⅢ的表达与肺癌患者化疗的疗效密切相关。

总之，肺癌对化疗的耐药是一个多基因、多因素的复杂过程，它们之间相互依赖、相互制约、相互调节。解决肺癌多药耐药的关键还在于全面深入地研究和阐明MDR产生的机制，寻求从根本逆转MDR的对策。我们相信，随着对MDR机理研究的深入，检测方法及逆转方法的不断改进，人类能够最终克服肺癌的MDR现象，在肺癌的化疗方面实现突破性进展。

(孙玉兰)

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