第九节 细胞因子检验
一、集落刺激因子检测
【原理】
1.生物学检测 集落刺激因子（CSFS）体外培养骨髓细胞或依赖株细胞，可形成造血祖细胞集落，其集落倍数的多少与CSFS生物活性有关。而CSFS的依赖株可在相应的CSF的作用下，其生长速度与MTT或3H-TdR掺入量有关。因此前者用体外形成的集数来反映体内CSFs活性，后者用MTT或3H-TdR来反映体内CSFs活性水平。
2.免疫学检测方法 ①ELISA法：由于集落刺激因子的骨髓细胞培养及依赖株增殖试验存在一定缺陷，因此，近几年来逐步被免疫学方法代替，其中以ELISA法备受许多实验室采用。ELISA法包括夹心法、间接法和竞争法三类。②免疫荧光法：细胞膜上结合的因子或细胞内源性因子可用特异性抗体作间接免疫荧光测定。待测细胞可以是悬浮的活细胞，也可是固定细胞或组织切片。③蛋白质电泳转移法测定：采用电泳方法将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维苏膜上，这种方法称蛋白质电泳转移。
【临床意义】
集落刺激因子测定已用于临床，但因为集落刺激因子在体内含量低，生物体内同时存在一些抑制因子，因此CSFs的测定受到限制。临床实验室主要以G-CSF，M-CSF，GM-CSF检测为主，其中用ELISA法测定G-CSF的国外报道较多，关于集落刺激因子测定的参考值未统一，各种方法有相应的参考值，因此在实际工作用，要结合人群的年龄、病种，建立自己实验室参考值，否则难以评价集落刺激因子的测定意义。
CSFs在体内由多种细胞和组织产生，这种产生机制在正常情况和病理条件下存在明显的差异，因此，CSFs检测在临床上主要有几个方面的意义：①有助于阐明有些疾病的发生机制，因为CSFs质和量的改变会导致相应的病变；②指导临床治疗；③阐明某些对造血系统有英雄爱你过药物作用机制；④判断某种因子在新的宿主细胞中有无表达，主要用于基因工程的研究；⑤对某些疾病的诊断及疗效观察有帮助。
1.在血液系统疾病中的意义 CSFs 检测对血液系统疾病发病机制、诊断、疗效观察有一定意义。
（1）再生障碍性贫血：再生障碍性贫血尤其是重型再障。其血清中GM-CSF、EPO、G-CSF粒-单核细胞集落刺激活性及血清体外红系爆式集落刺激活性（BPA），平均水平均增高。G-CSF可以作为SAA治疗效果判断的一项指标一般认为血清中G-CSF水平增高的SAA患者其疗效及预后较差。G-CSF水平在SAA治疗过程中也成动态变化，随着病情好转，其血清G-CSF水平逐渐降至正常水平。SAA患者EPO水平也明显高于正常人。在SAA治疗过程中EPO水平下降，说明治疗有效。
（2）白血病：CSFs异常可能与肿瘤有关，在造血细胞株的研究发现，经过基因转染而连续表达CSFs，可能导致肿瘤，这些是否因果关系，值得探讨。有现象表明：急性白血病中有 CSFs的产生，白血病病人的原始细胞中GM-CSF、G-CSF基因表达增加。
在急性早幼粒细胞白血病（APL）用全反式维甲酸治疗过程中，用ELISA法检测血清及骨髓单个核细胞及NB4细胞用全反式维甲酸诱导前后上清液中G-CSF水平，结果治疗前血清G-CSF检出率28%，治疗后检出率增加，在白细胞达到高峰前其阳性率最高，而后逐渐降低至阴性。说明G-CSF在APL患者用全反式维甲酸治疗过程中白细胞升高的发生机制中起一定作用APL细胞不分泌G-CSF。
2.感染性疾病中的意义 G-CSF水平的检测可作为细菌性感染的一个早期、快速、敏感的指标。用ELISA法检测各种细菌感染性疾病，大多数出现G-CSF水平的检出阳性率的增高。
二、白细胞介素检测
【原理】
1.生物学活性检测 主要根据细胞因子对特定的白细胞介素依赖株或敏感效应细胞促进或抑制作用，以细胞增殖时DNA的合成或酶活性作为指标，通过与标准品对比，间接推算出细胞因子的活性单位，一般用活性单位（U/ml）表示。通过这种方法检测的白细胞介素主要有IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7等。此方法灵敏，能测出pg水平的白细胞介素；能显示白细胞介素的生物活性。缺点：白细胞介素存在一个因子多种功能和多种因子一种功能，因此白细胞介素依赖株无法区别，除非采用单抗阻断；体液中存在的白细胞介素拮抗剂或受体能抑制细胞因子的功能，导致测出的白细胞介素水平较实际低。
（1）促进细胞增殖和增殖抑制法：检测白细胞介素促生长或抑制生长活性是将不同稀释度的待测样品或细胞因子标准品与培养的依赖细胞株共同培养一段时间，然后检测增值的细胞数。前者的细胞增殖数与细胞因子的含量成正比，而后者细胞增殖数与细胞因子的含量成反比。常用的细胞增殖的方法有3H-TdR掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色方法包括MTT 、XTT、 MTS和NAG等方法，可在酶标仪上自动化检测，且不接触同位素，较为常用。
（2）反向溶血空斑试验（RHPA）：RHPA是一种体外检测抗体分泌试验，其测定白细胞介素分泌细胞原理是将待测细胞分泌白介素的细胞置于单层经PSA包被的SRBC中，抗白细胞介素抗体被SPA固定在SRBC表面并结合待测细胞所分泌的白细胞介素。再补体存在时，白细胞介素和抗体的复合物激活补体，溶解附近的红细胞形成溶血空斑。空班的大小与细胞分泌的白介素的量成正比。本实验亦可用免疫化学方法染色溶血空斑中心的细胞以确定分泌白介素细胞的类型。
2.免疫学检测 将白细胞介素作为抗原进行定量分析，通过标准曲线，再推算样品的含量。目前用于白细胞介素的免疫学方法主要有：免疫斑点法、ELISA法、RIA法、免疫印迹法、酶联免疫斑点法（ELISPOTS）和反向溶血空斑法。每种白细胞介素只有相应的单克隆抗体可溶性受体均可采用免疫学法检测。此方法简单可靠，不需要维持细胞系。缺点：只能确定白细胞介素的含量，不能确定其生物活性；各种来源的抗体尤其是单克隆抗体所针对的表位不同，对白细胞介素的亲和力不同，因此结果有较大误差；免疫学方法的灵敏度较生物学方法低，但近几年ELISA法的灵敏度、准确性和客观性有了明显提高。ELISPOTS方法能检测到单个细胞分泌的白细胞介素，即能反映分泌白细胞介素的细胞频数，而且其显色后的结果分析已有原来的显微镜下计数发展为计算机扫描分析，其灵敏度、准确性大大提高。ELISPOTS的原理是先将抗细胞因子抗体包被固相载体（常用硝酸纤维膜），再加入相应的酶标抗白细胞介素抗体，即可通过酶测定与底物显色反应的深浅反映出结合在载体上的白细胞介素量。所用包被抗体与酶标抗体应分别针对白细胞介素的不同抗原决定簇。
3.分子生物学方法检测 目前主要采用的方法有RNA印迹法、核酸保护分析、斑点杂交、原位杂交和PR-PCR。主要通过细胞因子的基因转录mRNA的量，推断细胞因子的合成量。此法敏感度较高，有些细胞尽管有基因转录，却始终没有蛋白质的表达，因此分子生物学方法的检测并不能真实反映细胞的分泌状态，故分子生物学方法不能完全替代生物学方法或免疫学方法，而且其方法较复杂，试剂及仪器的条件限制。
4.细胞内白细胞介素的检测 随着流式细胞仪技术的广泛应用，采用FCM免疫荧光技术从单个细胞水平检测细胞内细胞因子，更确切地反映了不同细胞或细胞亚群产生细胞因子的能力，应用多色标记的荧光抗体可在一个细胞内测定多种不同的细胞因子。
【临床意义】
白细胞介素水平经常在有炎性反应或免疫应答时升高。
1.HIV感染、急性病毒性肝炎等多种微生物感染时IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12、IL-18等升高；曼氏血吸虫感染、线虫感染IL-4、IL-5、IL-9升高。
2.类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病时IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10 水平增高。而IL-1下降。
3.移植排斥反应、预防接种继发反应时IL-2、IL-4、IL-5转录（mRNA）升高，而IL-1下降。
4.宫颈癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、单核细胞白血病等恶性肿瘤时IL-6、IL-8升高。
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