常见生物样品的预处理

常见生物样品的预处理流程见图2－3。

图2－3　常见生物样品的预处理流程

根据不同生物样品类型的特点及药物的存在形式，需事先将被测物转化成易于提取纯化的形式。例如血样经去蛋白可以减少后续提取纯化的难度;尿液中以缀合物形式存在的药物经水解后脂溶性增强，利于后续的提取纯化;药物与毛发中的组分结合牢固，需经有机破坏才可使其释放，进而被提取纯化。如果选用的分析方法特异性强，可不经提取纯化直接测定。对于提取纯化后药物浓度较低的样品需要进行富集，有必要的时候可采用化学衍生化方法提高分析的灵敏度和特异性。通常体内药物分析测定的是药物或代谢物的总浓度(包括游离型及结合型)，但在一些特殊情况下，如蛋白结合率试验，则需要将游离型药物与结合型药物分离，测定游离药物的浓度。

下面就常见的预处理方法:去除蛋白质、缀合物水解、有机破坏、游离药物的分离、提取纯化、富集、化学衍生化进行讨论。

2.2.2.1　去除蛋白质

血样和组织样品中存在大量的蛋白质，药物在这些样品中可能以蛋白结合的形式存在。一般情况下蛋白沉淀的时候，药物会被释放出来，可测得药物的总浓度。另外蛋白质为大分子物质，对后续的提取纯化干扰很大，对分析仪器的污染也很严重。去除蛋白质的方法有多种，根据原理可分为三类:蛋白质沉淀法和蛋白质溶解法。

1.蛋白质沉淀法

蛋白质具有胶体性质，在水中可溶的原因有两个方面:一是蛋白胶粒上的电荷互相排斥，不易凝集成团;二是胶粒表面的水化膜，使其与水充分接触，又可在胶粒之间起隔离作用。当这两种平衡被破坏时，蛋白质将会沉淀析出。根据作用机理大致可分为两类。

(1)盐析和脱水:高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时抑制蛋白质的解离，减少蛋白质胶粒表面的电荷，从而破坏水化膜使其凝聚沉淀。常用的中性盐有:饱和硫酸铵、硫酸钠、氯化钠及磷酸盐等。如按血清与饱和硫酸铵的比例为1 2混合，即可除去90%以上的蛋白质。所得上清液的pH为7.0～7.7。采用此法时要注意中性盐残留对分析仪器的影响。

与水相混溶的有机溶剂，如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃等，可与蛋白质争夺水化膜，降低水的介电常数，抑制蛋白质的解离，使表面的电荷量减少，增加蛋白质颗粒之间的引力，使其聚集沉淀。沉淀蛋白效果最好的是乙腈，在生物样品中加入1.5倍体积的乙腈即可以除去99%以上的蛋白质，所得上清液的pH为8.5～9.5。采用此法会稀释样品，降低方法的灵敏度，同时会带来较多的干扰成分。但该法操作简单，尤其适合极性较大的药物。

盐析法一般不会引起蛋白质变性，常用于蛋白质的分离。而有机溶剂与蛋白质接触较久后，会使其变性，形成不可逆沉淀。

(2)成盐:蛋白质为两性大分子，结构中既有羧基又有氨基。当溶液的pH高于蛋白质等电点时，蛋白质的羧基带负电荷，可与带正电荷的重金属盐类结合形成不溶性盐而沉淀;当溶液的pH低于蛋白质等电点时，蛋白质的氨基带正电荷，可与带负电荷的酸根离子结合形成不溶性盐而沉淀。常用的酸性阴离子沉淀剂有三氯乙酸、高氯酸、钨酸盐等，常用的重金属盐类主要有锌盐、铜盐和汞盐。其中三氯乙酸的沉淀效果最好，按血清与三氯乙酸的比例为1 0.2混合，即可除去99%以上的蛋白质。所得上清液的pH为1.4～2.0，在酸性条件下易分解的药物不宜采用本法。

(3)加热使变性:当待测成分热稳定性好时，可采用加热的方法除去热变性蛋白，加热温度视待测成分的热稳定性而定，通常加热至90℃。该法简单，但除蛋白质的效果一般，现在很少应用。

析出的蛋白质必须采用超速离心机(≥10000 r·min－1)离心1～2 min才可完全除去，离心时选用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液与沉淀的分离。

2.水解蛋白质法

蛋白质的肽键在蛋白水解酶的作用下可发生降解，释放出结合的药物。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素，通常在50～60℃的碱性pH溶液(pH7.0～11.0)中水解。也可合用一些蛋白酶增活剂，以便减少酶用量和缩短水解时间。对于酸不稳定、热不稳定及蛋白结合牢的药物，此法是不错的选择。但此法不适用于在碱性条件下易水解的药物。

2.2.2.2　缀合物水解

含羟基、羧基、氨基和巯基等基团的药物及具有类似基团的Ⅰ相代谢物，可与内源性物质(如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等)形成缀合物(conjugate)，经肾脏排泄。由于缀合物的极性一般较原型药物大，具有较大的亲水性或在生理pH下以电离形式存在，不易被有机溶剂提取。为了测定药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，常需将缀合物中的药物或代谢物水解游离出来。常用的方法有酸水解、酶水解和溶剂解。

1.酸水解

加入适量的无机酸可使缀合物发生水解。常用的无机酸为盐酸，酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件应通过实验来确定。该方法较简便、快速，但不适于遇酸不稳定的药物。

2.酶水解

生物体内存在一些专一水解缀合物的酶，如葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase)可专一地水解葡萄糖醛酸苷缀合物，硫酸酯酶(sulfatase)可专一地水解硫酸酯缀合物。葡萄糖醛酸苷和硫酸酯为最常见的缀合物种类，故实际应用中常用葡萄糖醛酸苷酶－硫酸酯酶的混合酶，在37℃、pH 4.5～5.5的条件下孵育数小时进行水解。

酶水解专属性强，条件温和，不易造成被测药物或代谢物的降解。虽然酶试剂较贵，水解的时间较长，以及酶制剂带入的黏液蛋白可能对后续的分析有干扰，但酶水解法仍为首选的方法。

采用酶水解时要注意减少生物样品中存在的其他酶对测定结果的影响;尿液中存在抑制酶的阳离子，水解前应先除去。

3.溶剂解

硫酸酯缀合物在用有机溶剂进行萃取的过程中会直接被水解，称为溶剂解(solvolysis)。该方法的水解条件也较温和。

值得注意的是缀合物水解后测得的是药物的总量。如要了解药物在体内转化为缀合物的量以及缀合物占排出药物总量的比率时，则需直接测定缀合物的含量。

2.2.2.3　有机破坏

生物样品中的微量金属和非金属元素通常以有机结合状态存在，对其进行测定时，通常要将有机物分解，使待测组分转变成易于测定的无机化合物或单质，然后进行测定。常用的有机破坏法可分为湿法破坏和干法破坏两种类型。主要用于毛发、血、尿、组织等生物样品中无机金属元素的测定。

1.湿法破坏

将生物样品置于消解液中，经加热处理(一般温度需≥150℃)，生物介质被氧化破坏游离出待测组分。常用的消解液为硝酸或以硝酸为主的混合酸，盐酸、氢氧化钠、过氧化氢等也可作为消解液。常用的加热方式为电热消化器法、电热板消化法和烘箱消化法。

2.干法破坏

本法系将生物样品经高温炽灼或燃烧破坏，待生物介质灰化、挥发后，取适当试剂将待测物溶解或转变成稳定形式，再进行下一步处理。含氮杂环类化合物用湿法破坏时不易破坏完全，宜选用干法灼烧进行破坏。

传统的湿法破坏和干法破坏操作时间长，挥发性元素易损失。近年来，一种新的有机破坏方法——微波消解法在生物样品制备中得到了一定的应用。该法结合了高压消解与微波快速加热两方面的性能，在密闭容器内进行有机破坏。具有操作简便、溶剂用量少、消化完全、无元素损失及多元素测定的优点。

2.2.2.4　游离药物的分离

在药物蛋白结合率测定及游离药物的治疗药物监测中，常需将游离药物与蛋白结合药物分离。利用游离药物与结合药物分子量差异较大的特点可采用膜分离法或超离心法、凝胶过滤法等方法进行分离。常用的膜分离法包括平衡透析法(equilibrium dialysis)和超滤法(ultrafiltration)。两种方法均采用半透膜作为分离介质，通常所选半透膜的截留分子量为10000～30000 Da。平衡透析法为一种静态的分离模式，而超滤法需在3000～10000 r·min－1下离心5～15 min。由于超滤过程中血浆水分逐渐过滤除去，使血浆蛋白的浓度不断增加，可能影响药物的蛋白结合率，因此蛋白结合率的测定常用平衡透析法。

2.2.2.5　常用的提取纯化技术

经去除蛋白质、缀合物水解及有机破坏的生物样品中仍然存在大量的内源性杂质，需要进一步提取纯化。常用的提取纯化方法主要有液－液萃取技术和固相萃取技术。

1.液－液萃取技术

液－液萃取(liquid－liquid extraction，LLE)是利用不同组分在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同，来达到分离、提取或净化的目的。多数药物属于亲脂性的化合物，在有机溶剂中的溶解度大于水中的溶解度;而生物样品中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，操作简便，重复性好。

影响液－液萃取的因素包括:有机溶剂的种类、有机相与水相的容积比、提取的次数、水相的pH及离子强度等。

(1)有机溶剂的种类:有机溶剂的选择直接影响液－液萃取的效率和选择性。理想的有机溶剂应满足下列条件:①对待测成分有大的亲和力;②与水不相混溶;③沸点低，易挥发;④化学性质稳定和惰性;⑤无毒、不易燃烧;⑥不易产生乳化;⑦不影响后续的检测。但在实际应用中，上述条件往往不能全面兼顾，只能根据实际情况择其重要条件进行选择。较高的提取率和提取的重复性是选择的重要依据。液－液萃取常用的有机溶剂见表2－2。

表2－2　液－液萃取常用有机溶剂

续表2－2　

乙醚、三氯甲烷和二氯甲烷等溶剂萃取能力强、又易于挥发、富集，为常用的提取溶剂，也可用混合溶剂提取。乙醚在水中有一定的溶解度，选用乙醚作提取溶剂时，应在提取前加入适量的中性盐(如固体氯化钠)以减少乙醚中的含水量，或在乙醚萃取液中加无水碳酸钠脱水，以减少水溶性杂质的干扰。

(2)有机相与水相的容积比及提取次数:生物样品中药物的浓度一般较低，用大量的溶剂提取会进一步稀释药物的浓度，不利于检测。故有机溶剂的用量和次数不可过多，只要保证提取率＞50%且稳定即可。一般有机相与水相的容积比为1 1或2 1，且只提取1次，最多不超过2次。

(3)水相的pH:水相的pH直接影响弱酸、弱碱性药物的电离状态，一个合适的水相pH是保证高提取率的前提。当水相pH与药物的pKa值相等时，有50%的药物以非电离形式存在;当水相pH低于酸性药物的pKa值2～3个单位，或水相pH高于碱性药物的pKa值2～3个单位时，有99.0%的药物以非电离形式，易被有机溶剂提取。因此水相pH选择的基本原则是:碱性药物在碱性条件下提取;酸性药物在酸性条件下提取;由于内源性杂质偏酸性，中性化合物一般在偏碱性条件下提取。为了获得可重复的提取率，水相中需加入合适的缓冲溶液来稳定水相的pH。

(4)离子强度:加入一定量的中性盐(如氯化钠)，可以增加水相的离子强度，降低药物在水中的溶解度，利于提取。同时中性盐的加入可减少提取时的乳化现象。

液－液萃取技术的缺点是需要消耗大量有毒有害的有机溶剂、繁琐费时、提取过程中易发生乳化现象、不适于提取强极性或多电荷药物、难以实现自动化等。近年来，各种新型的液－液提取技术不断出现，在体内药物分析中的应用也在不断增加。液－液萃取新技术将在“2.2.3生物样品预处理新技术”中简单介绍。

2.固相萃取法

固相萃取法(solid－phase extraction，SPE)是利用色谱理论，取装有不同填料(具有吸附、分配及离子交换性质的担体)的小柱进行生物样品制备的技术。其原理是利用含药生物样品溶液流经萃取小柱时，由于药物和干扰组分与填料的作用力有差异，从而使药物被选择性地保留或洗脱，达到提取纯化和富集的目的。与LLE比较，SPE具有明显的优势:不存在乳化现象，回收率高，选择性强，分离时间短，有机溶剂用量少，易于自动化等。固相萃取已成为体内药物分析中最常用的前处理方法。

(1)固相萃取柱的选择:SPE的填料种类繁多，可分为亲脂型(化学键合硅胶、大孔树脂)、亲水型(硅藻土、硅胶和棉纤维)和离子交换型三类。不同类型的填料提高了固相萃取的选择性，其中十八烷基硅烷键合硅胶(简称C18)最常用。待测组分的理化性质、生物样品溶液的体积及待测组分的含量是固定相选择的依据。首先根据待测组分的溶解性质、是否带电荷等理化性质来选择填料的种类，并通过预试找出最适合的柱填料。然后根据被萃取物的量来选择填料量的规格，一般被萃取物的量不得超过填料量的5%。如柱填料为100 mg的固相柱，被萃取物的量应不大于5 mg。最后根据生物样品的体积来选择固定相的柱体积，一般柱体积应大于样品溶液的体积，比如2 mL的样品溶液可选用3 mL体积的固相柱。

近年来，SPE填料的种类与数目迅速扩大，使固相萃取技术在生物样品制备中的应用越来越广泛。为了保证萃取结果的重现性，实际应用中大都选择商品化的固相萃取小柱(示意图见图2－4)。

图2－4　固相萃取小柱示意图

(2)生物样品溶液的前处理:固相填料的粒度一般为40～80μm，含有大颗粒杂质的生物样品可能会堵塞柱子，因此含有蛋白质的血液样品和组织样品在进行SPE制备之前最好先进行沉淀蛋白处理。尿液、细胞培养液等一般无需处理即可进行固相萃取，但若含有颗粒则需经离心处理。另外，根据药物的理化性质及与填料的作用力特点，需通过适当处理(如调节样品溶液的pH)将药物转化成便于吸附或洗脱的形式。如碱性药物选用C18化学键合硅胶小柱进行预处理时，需将生物样品溶液的pH调至碱性，使药物呈游离状态，易于被C18化学键合硅胶吸附。

(3)固相萃取步骤:以C18化学键合硅胶小柱的一般操作为例。

第一步:柱活化。为了保证萃取率的重现性，小柱必须用适当的溶液进行活化处理。对于C18柱，首先用柱填料6～8倍体积的甲醇来活化，可达两个目的:一是展开碳氢链，增加填料与待测组分作用的表面积;二是除去填料中吸附的杂质。然后用6～8倍体积的水或缓冲液洗去多余的甲醇，因为C18柱在甲醇含量约8%的水溶液中才能保持湿润，从而有利于药物的吸附。

第二步:上样。取已处理的生物样品溶液按照一定速度经过小柱，弃去废液。

第三步:柱洗涤。用水或适当的缓冲液冲洗小柱，弃去洗液，除去与填料无作用或作用弱的内源性物质和其他干扰物质。

第四步:洗脱。选择合适的洗脱溶剂洗脱待测组分，收集洗脱液以备后用。洗脱剂的洗脱能力要足够，单一种类溶剂洗脱能力不足时，可用混合溶剂;另外洗脱溶剂的用量不可太大，如需浓缩尽可能选择沸点较低的有机溶剂。

固相萃取基本步骤示意图见图2－5。

图2－5　固相萃取基本步骤示意图

(4)注意事项:在整个固相萃取过程中，固相柱都需保持湿润，以免影响提取效率;样品量应控制在固相柱的有效装载量内(一般为填料质量的1%～5%)，填料的吸附会饱和，过载会造成回收率下降;流速要控制，太快待测成分与填料不能充分接触，使分离度下降、待测成分流失、重复性差，一般活化和洗涤时的流速为5～10mL·min－1，上样和洗脱时的流速以0.2～1 mL·min－1为宜。

(5)固相萃取法的缺点:商品化的固相萃取小柱为一次性耗材，使用成本高;对操作技术要求较高;不同批次小柱的提取率有差异;柱子易堵塞，一般样品需进行预处理。

(6)自动化固相萃取:固相萃取法中，人工操作易引入较大的误差，可通过采用自动化的固相萃取装置(市售自动化固相萃取仪见图2－6)来降低预处理过程中的误差。同时自动化固相萃取装置易与分析仪器(如HPLC、CE等)联用实现在线分析。

2.2.2.6　富集

经过提取纯化，尤其经液－液萃取法，提纯后的待测成分被转移至较大体积的有机溶剂中，虽然得到了纯化，但浓度往往较低，达不到分析方法的检测灵敏度，还不能直接进行分析，常需将被测组分富集后再进行测定。富集的方法主要有两种:一种是在末次提取时加入尽量少的提取液(数毫升)，提高待测成分的浓度;另一种是挥干溶剂，然后再用适于后续分析方法的小体积溶剂复溶。实际操作中，后一种方法的应用较多。但挥干溶剂时应避免直接加热，防止被测组分破坏或损失。常用挥干溶剂的方法是直接通入氮气流和空气流吹干，也可适当加热。对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。

图2－6　GX－271 ASPEC自动固相萃取仪

2.2.2.7　衍生化

大部分药物经预处理后可直接进行分析，但一些极性较大、挥发性差、稳定性差，或不具紫外、荧光性能，检测灵敏度低的药物则需进行衍生化处理。如在GC分析中，一般要求药物具有挥发性，对热稳定等，对于挥发性差、对热不稳定的药物则需进行化学衍生化。HPLC法通过衍生化处理，可以达到提高药物检测的灵敏度，增强药物的稳定性，改善分离效果等目的。此外，手性药物的拆分常采用手性试剂衍生化法，将对映体转变成非对映异构体后用常规色谱法进行分析。

气相色谱法常用的衍生化反应有硅烷化、烷基化、酰化、酯化、卤代衍生化等。其中硅烷化是应用最广泛的方法之一。药物分子中的羟基、氨基、羧基、巯基等极性基团中的活泼氢均可被硅烷基取代，使药物变成极性低、易挥发和热稳定性好的硅烷基衍生物。酰化主要用于氨基化合物的衍生化处理，也可用于羟基、巯基化合物的衍生化。酯化主要用于含羧基化合物的衍生化处理，可提高有机酸的挥发性。卤化衍生物能采用灵敏度较高的电子捕获检测器，提高药物的检测灵敏度，同时也可改善药物的挥发性和稳定性。常用的GC衍生化试剂包括硅烷化试剂:三甲基氯硅烷、双－三甲基硅烷乙酰胺、双－三甲基硅烷三氟乙酰胺、三甲基硅烷咪唑等;烷基化试剂:碘甲烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺等;酰化试剂:乙酸酐、丙酸酐等。

拆分光学异构体时需用到不对称试剂，常用的不对称试剂有:三氟乙酰脯胺酰氯、五氟乙酰脯胺酰氯等。

采用HPLC法时，衍生化的目的主要是为了提高药物的检测灵敏度。邻苯二醛、荧胺等常用的衍生化试剂适用于氨基酸、肽类药物;丹磺酰氯、异氰酸、β－萘酯等适用于含有胺基、酚羟基、羧基、巯基的药物。

按衍生化反应与色谱分离的时间前后，HPLC化学衍生化法可分为柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。柱前衍生化的优点是衍生化条件较宽松，不受色谱系统的限制，也不需附加的仪器设备。由于柱前衍生化法是取未分离的样品与衍生化试剂反应，故具有相同官能团的药物和杂质均会发生衍生化反应，产生干扰组分;且衍生化反应率较低。因此，应尽可能将样品进行精制后再衍生化，操作较繁琐。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后，即刻与衍生化试剂反应，生成的衍生物进入检测器检测。为了保证流出柱后的药物衍生化反应完全，在测定过程中必须使衍生化试剂处于流动状态，以便及时与药物接触，这需要附加仪器设备。两类方法中柱后衍生化法更适合于连续的自动化分析。究竟选用哪种方法，需视不同情况而定。