常见病原微生物分离和培养

细菌培养是将所需细菌在特定条件下大量增殖的过程，细菌培养是细菌鉴定、致病力研究、疫苗制备必须掌握的基本技术。细菌培养必须是对目的细菌的纯培养，因此不能混入其它杂菌，否则所有的实验结果都无法分析。无菌操作是细菌培养必须掌握的最基本操作。

一、培养基

细菌必须在合适的培养基中才能生长繁殖，不同种类的细菌对于营养要求有显著的差别。培养基是用人工方法将多种营养物质根据细菌的生长需要配合而成，含有可被细菌利用的氮源、碳源、无机盐和水等物质。蛋白胨是细菌培养基最常用的营养物质，某些细菌需要类似维生素的辅助生长因素才能生长，而且同一培养基又由于原料品种的不同而质量不同。

水生动物致病菌分离常用培养基有：普通营养琼脂、血琼脂、SS琼脂、2216E培养基、TSA培养基、TCBS培养基、麦康凯琼脂、气单胞菌选择培养基和副溶血弧菌选择培养基等。

1.营养肉汤(NB)和营养琼脂（NA）

配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0克，Na Cl 5.0克。

配制方法：上述成份，依次加到蒸馏水中，充分溶解（为加快溶解可稍加温），加水至1升，1M Na OH调节p H值7.4～7.6，分装，0.112 Mpa 高压灭菌15～20分钟。

营养琼脂的配制：取配制好的营养肉汤，根据体积加入1.5%（重量/体积）加入琼脂粉，高压灭菌15～20分钟即可。

平板制备：高压灭菌结束后，应趁机趁热摇动装培养基的三角瓶或试剂瓶，使琼脂粉均匀混合。可待温度降至56℃左右倒平板或冷却后4℃保存，使用时电炉或微波炉加热充分溶化后倒平板。

营养肉汤和营养琼脂的主要成份是蛋白胨和牛肉膏粉，这两种成份均为天然培养基原料，可提供细菌生长所需的氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。营养琼脂和营养肉汤适合于大多数细菌的生长，是细菌分离培养的通用培养基。营养琼脂的质量一般用金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）或大肠埃希菌（ATCC 25922）来判别，金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均在上面良好生长，分别形成淡黄色和无色透明菌落。常用于病原气单胞菌、假单胞菌、肠杆菌等营养琼脂上可良好生长。

营养肉汤和营养琼脂也可作为基础培养基，添加相关成份后用于其他细菌培养。培养海水弧菌时，可在营养肉汤中加氯化钠至 1.5%～3.0%浓度，可用于培养副溶血弧菌等；培养葡萄球菌时，可在营养肉汤中加入0.1%的葡萄糖，可提高细菌的培养浓度。

2.胰胨大豆培养液（TSB）

配方：胰蛋白胨 15.0克，大豆蛋白胨 5.0克，氯化钠 5.0克。

注：有些配方中，还加入葡萄糖2.5克和磷酸氢二钾2.5克。

配制方法：上述成份，依次加到蒸馏水中，充分溶解（为加快溶解可稍加温），加水至1升，用1 M Na OH调节p H值7.2～7.5，分装，0.112 Mpa 高压灭菌15～20分钟。如需制备固体培养基，可按体积加入琼脂粉1.5%。

胰胨大豆培养液的主要成份是胰蛋白胨和大豆蛋白胨，这两种成份均为天然培养基原料，可提供细菌生长所需的氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂为培养基凝固剂。适合于大多数细菌的生长，是细菌分离培养的通用培养基。胰蛋白胨又称胰酪蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的优质蛋白胨，含有丰富的氮源、氨基酸等，可配制各种微生物培养基。质量良好的胰蛋白胨为浅黄色粉末，比起蛋白胨，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等优点，制备的培养基底色较浅，易于细菌菌落的观察；大豆蛋白胨是大豆蛋白经胰酶消化而成，蛋白含量可高达80%，且成本比动物蛋白胨低，营养丰富，含有低分子肽和氨基酸，有利于微生物生长、繁殖。常用于病原气单胞菌、假单胞菌、肠杆菌等可在TSA上良好生长。培养基中也可添加氯化钠浓度，使之适合于海水弧菌的分离培养。

3.2216E培养基

配方：蛋白胨5.0克，酵母膏1.0克，磷酸高铁0.1克，陈海水（或沉淀海水）1000毫升。

配制方法：上述成份依次加到陈海水中，加热溶解，用氢氧化钠溶液调节p H值7.6，分装， 121℃（约105 k Pa）高压灭菌15～20分钟。

注：本培养基国外称为海水培养基 2216E（Marine broth 2216E），国外配方与国内文献不同，是全配方，直接添加蒸馏水即可，减少了不同海水成份对培养基的影响。

2216E培养基为成份较为复杂的培养基，充分考虑了海水细菌的特点，适合于大多数海水细菌的培养，对于弧菌也有良好的支持作用。对于某些海水弧菌来说，2216E上的生长速度要慢比添加氯化钠的营养琼脂。国内有成品供应，一般取成品37.4克，溶解于蒸馏水中，加体积至1000毫升即可。如需制备固体培养基，可加入1.5%琼脂粉，高压灭菌即可。

4.TCBS培养基

配方：酵母膏粉5.0克，蛋白胨10.0克，氯化钠10.0克，柠檬酸钠10.0克，代硫酸钠10.0克，胆酸钠3.0克，牛胆粉5.0克，蔗糖20.0克，柠檬酸铁1.0克，琼脂15.0克，溴麝香草酚兰0.04克，麝香草酚兰0.04克（p H 8.6左右）。

配制方法：取培养基89.0克，加入蒸馏水1升，加热搅拌煮沸溶解后，待冷至50℃左右，倒平板，凝固后备用。TCBS培养基不能高压灭菌。

TCBS 培养基中的蛋白胨、酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持渗透压；蔗糖提供细菌发酵的碳源；胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的p H可抑制革兰阳性菌和大肠菌群生长，同时可促进霍乱弧菌等弧菌的；硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂；溴麝香草酚兰和麝香草酚兰是p H指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。

TCBS 培养基制成平板后为绿色，无沉淀。是肠道致病性弧菌特别是霍乱弧菌和副溶血性弧菌的选择性分离基，也是目前使用最为普遍的弧菌选择性培养基。根据弧菌对蔗糖利用后的产酸特性可区别部分弧菌，其中利用蔗糖产酸的霍乱弧菌和溶藻弧菌可出现黄色菌落，而副溶血弧菌则因不产酸而出蓝绿色菌落。大肠埃希氏菌和其他革兰阳性菌在TCBS上生长很差。

5.气单胞菌选择培养基（Rimler-Shotts Medium，R-S)

配方：L-盐酸赖氨酸5.0克，L-盐酸鸟氨酸6.5克，L-盐酸半胱氨酸0.3克，麦芽糖3.5克，硫代硫酸钠6.8克，柠檬酸铁铵0.8克，脱氧胆酸钠1.0克，氯化钠5.0克，酵母提取物 3.0克，新生霉素0.005克，溴酚蓝0.03克，琼脂粉13～15克。

配制方法：上述成份依次加至蒸馏水中，加水至1升，调p H值7.2～7.4，煮沸1分钟，冷至45℃倒平板备用。

主要用于气单胞菌的选择性鉴别培养，气单胞菌形成无黑色中心的黄色菌落，灭鲑气单胞菌需在低温下培养，耶尔森氏菌也可形成黄色菌落，但氧化酶阴性。本培养基对柠檬酸细菌和其他一类肠杆菌科细菌从菌落颜色上无法区别，但可通过氧化酶测定来鉴别之。

除了上述培养基，目前许多公司还生产了其他适合于细菌选择性培养的培养基，大大降低了工作强度，为细菌培养和鉴定带来了极大的便利。选择性培养基存在选择性较为局限的问题，实际应用时常采用数个不同的选择性培养基。但选择性培养基不能代替细菌鉴定对疾病的判断，因此最终的结果还需要通过细菌的生化或分子鉴定。

二、细菌培养和分离常用的器皿和设备

分离培养细菌时应注意选择合适的培养基、培养温度和气体条件等，同时要严格按无菌操作进行。细菌培养常用器皿：

1.培养皿

培养皿一般细菌培养采用直径为90毫米，最常用的用途是将未凝固固体培养基倒在平皿上，冷却后可形成表面光滑的固体培养基，适合于细菌的培养和分离。目前国内许多实验室采用玻璃平皿，一次投入较大，但可反复使用。近年来，较多地使用塑料灭菌一次性培养皿，但一次使用成本还是较高。

2.接种环和接种针

接种工具最好用铂金丝制成，也可用镍铬丝，用于细菌接种。与细菌接触端为环状称为接种环，针状为接种针（有的书将两者通称接种棒）。使用时，需将接种端在酒精灯火焰上烧红，以杀死沾染的细菌，待其冷却后（也可与无细菌地带的培养基或器皿接触，加快冷却），挑取少许待接种细菌或材料，进行细菌分离培养。

3.超净工作台

超净工作台又称净化工作台，内有照明灯、紫外灭菌灯，并有无菌空气过滤系统，空气经过滤灭菌后，经工作台面向外吹出，有效防止外面有菌空气的进入，保证了工作台面的相对无菌状态。超净工作台是保证操作无杂菌污染的重要设备。按超净工作台的设计要求，甚至在普通房间内工作，也可保证工作区的无菌状态。应定期用培养基测定平均菌落数，一般应保证每个平板每小时不超过0.5个菌落（≤0.5个/皿·小时）。

4.高压灭菌锅

高压灭菌锅又称高压蒸汽灭菌锅或简称高压锅。通常在 0.1 MPa 压力下，温度可达121.3℃，在此条件下灭菌 15～30分钟，可完全杀死灭菌物品的微生物和芽胞及孢子。此法可用于各种耐热培养基、试剂、玻璃器皿等物品的灭菌。高压锅分为立式、卧式和手提式几种。目前已有可设定压力和灭菌时间的自动式高压锅，使用更为方便和稳定。

三、微生物实验室常用物品的灭菌

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

1.干热灭菌法（烘箱灭菌）

干热灭菌主要适用于干热情况下不损坏、不变质、不蒸发的物品，一般用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等灭菌，用于PCR的枪头，也可用干热灭菌法，以保证RNA酶的充分灭活。

灭菌前准备 所有需灭菌物品应先清洗晾干，以防在表面污物炭化；玻璃器皿用纸包装严密，待灭菌物品放入烘箱时，装放物品不可过挤，不能接触箱的四壁。

灭菌 物品装放完毕后，关紧箱门，打开电源，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5～2.0小时。灭菌完毕后待温度降到60℃以下，打开箱门。

2.湿热灭菌法（高压灭菌）

湿热灭菌主要用于在干热情况易损坏、变质的物品，微生物实验室一般用于灭菌的有培养基、试剂、离心管、枪头、玻璃器皿、注射器等以及培养细菌后待丢弃的废培养基。

高压锅检查和准备 检查压力表是否在零位，有无漏气情况和管道堵塞；高压锅主体内水量是否充足，水是否过混浊需更换；手动高压锅还需检查排气管插入消毒桶内壁的方管中；自动电子程序控制装置的高压灭菌器，按操作规定检查。

灭菌前准备 装培养基的三角瓶塞用纸包好，注射器灭菌前须将管芯抽出再包好；待灭菌物品分别包装放于消毒筒内，物品之间不能过挤；用瓶塞的试剂，要将瓶塞旋松，灭菌后再盖紧；用金属筒应将上面通气孔打开，灭菌后及时盖好。

灭菌处理 盖好并拧紧高压锅顶盖，勿使漏气，开始灭菌。手动高压锅要打开顶盖上排气阀放了冷气至水沸腾后10～15分钟，再关闭排气阀使蒸气压上升到规定要求，维持规定时间。自动控制式高压灭菌器，可按物品类别选择相应开关，按要求程序自动灭菌即可。

灭菌结束 达到规定时间后切断电源，如消毒物品为培养基等液体材料，应等压力下降到零后，打开高压锅；如有需要干燥的物品，可待压力下降至5镑以下时，缓慢打开排气阀排出蒸气，自然冷却后取出物品。

潮湿物品的烘干 如灭菌物品为棉花、纱布、枪头等物，可待冷却后取出，在50℃烘箱干燥1～2小时，置无菌室备用。

高压灭菌液体时，维持压力到规定灭菌时间后，切不可打开排气阀快速排蒸气，以免造成液体剧烈沸腾或容器爆破。

四、无菌操作

无菌操作是细菌学分析正确性的重要保证，无菌操作是指微生物实验中，控制或防止各类微生物污染及干扰的一系列操作方法和措施，包括无菌实验环境、无菌实验器材和试剂、无菌操作技术等。

1.无菌环境

保证无菌实验环境最常用的办法是无菌室、超净工作台（或无菌柜），超净工作台使用前应提前用紫外灯杀菌30分钟，关闭后开风机10～20分钟再使用；超净台应定期检测无菌状态，每2～3月将预滤器的布滤拆下清洗或更换。实验结束后，超净台表面应使用75%酒精擦洗，并用紫外灯杀菌20～30分钟。在野外进行病原分离培养时，也可利用酒精灯火焰提供的一个局部无菌区，进行简单的病鱼取样和分离。

2.无菌器材和试剂

所有使用的器材，能灭菌的必须灭菌处理，包括所有的玻璃器皿、培养基、稀释液、解剖工具，解剖用具也可用75%乙醇擦表面后用火焰灼烧，此外需要进入超净台的物品，如试管架、天平、试剂瓶等，以及操作人员双手，都应使用75%酒精擦洗或用75%酒精喷瓶喷射。

3.无菌操作技术

无菌操作是在无菌环境下，防止微生物污染和干扰的操作方法，以保证待检物品不被环境中的微生物污染，同时也要防止被检微生物在操作过程中污染环境和操作人员。酒精灯是保证操作无菌的重要用具，所有操作都要求在酒精灯火焰附近进行，在非无菌区不能打开已灭菌物品、试剂及培养物。

五、细菌接种操作方法

1.接种环的消毒

右手持接种环，将环在酒精灯火焰上将环烧红，再将杆部在火焰上慢慢通过，往复一次，不需烧红；接种结束后，同法灼烧接种环。

2.平板划线分离法

平板划线分离法是接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种方法，通过将微生物样品在固体培养基表面多次“由点到线”的稀释而达到分离单菌落的目的。操作过程如下：

（1）酒精灯火焰灼烧接种环，冷却后挑取菌液或菌落；

（2）左手握琼脂平板，稍打开皿盖并靠近火焰周围，右手将接种环伸入皿内，在平板上一个区域作之形划线，划线时例接种环与平板表面成30°～40°角度轻微接触，以腕力在表面作轻快滑动，勿划破平板表面；

（3）灼烧接种杯，杀灭接种环上残余细菌，冷却后将接种环在第一区域划过线的地方接触一下后，转动平皿， 在第二区域继续划线；

（4）划毕后再灼烧接种杯，同法在其他区域划线；全部划线完毕后，在平皿底用记号笑注明接种信息，恒温培养。

图13 平板划线操作示意图

3.斜面接种法

主要接种已纯化的单菌落，保存纯种细菌或菌种，及观察细菌的培养特性。

（1）左手持菌种管（平皿），右手将接种环火焰灭菌；

（2）以右手小指与手掌拔取棉塞，将管口迅速通过火焰 l～2次以杀灭管口细菌；

（3）将灭菌接种环在菌种管（平皿）斜面取少许菌，迅速伸入待接种培养基管中，将斜面底部向上划一条直线，再从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。培养18～24小时即可观察结果。

液体接种法方法大致与此同，只是用液体培养基代替斜面，接种时要求将接种物充分混合于培养液中。

4.穿刺接种法

适用于半固体培养基接种，用于菌种保藏、动力学观察及厌氧试验等。方法如下：

（1）左手持菌种管和培养基管，右手将接种针火焰灭菌后，从菌种管取菌；

（2）将接种针直刺入培养基的中心直达管底部，一般需深入培养基3/4处，接种后接种针沿原路退出。醋酸铅试验时应沿管壁刺入。

培养后观察结果。运动性观察时，如细菌沿穿刺线生长，线外培养基清亮者表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊者表示细菌有动力。

图14 斜面、穿刺和液体培养基接种方法

六、微生物实验室污染物的处理

水生动物病原对人类健康和环境安全具有一定的潜在危害性，因此，水生动物微生物实验室的实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。一般要水生动物病原微生物相关的有毒和有菌污物处理，可遵循以下原则：

1.水生动物微生物实验室所有培养物、污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，集中存放在指定地点，统一进行高压灭菌。

2.经微生物污染的培养物，必须经121℃，30分钟高压灭菌。

3.染菌后的吸管，使用后放入消毒液中浸泡至少24小时，再经121℃，30分钟高压灭菌后重新清洗使用。

4.涂片染色有关废液可直接冲入下水道，但具有较强传染性或列入国家一类疫病的病原冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道；染色玻片经消毒液浸泡24 小时后，煮沸洗涤；做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。

5.实验室鼓励使用一次性用具用于致病微生物实验中，致病微生物实验用过的枪头、离心管等，须经高压灭菌后再统一丢弃。

6.病原微生物培养物如不小心打碎，应立即用消毒液对污染区进行喷洒，并同时浸泡污染部位浸泡半小时后，再擦拭干净。

7.污染工作服或进行强致病性病原过程所穿工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。

七、病原微生物分离

水生动物病原微生物分离是指从养殖水体、患病水生动物或待测其它标本中得到病原微生物纯培养的过程。包括待测样品的预处理、微生物分离和培养，获得培养物后，才能对微生物开展全面分析。这个过程一般可在2～4天内完成。对于一些难培养的细菌相对较长，如分枝杆菌引起的鱼病，可长达数周甚至数月。

1.养殖水体病原微生物的分离培养

从水体分离细菌也可采用划线，但一般采用涂布的方法。基本过程为：取待分析水体，用灭菌水或生理盐水作10倍系列稀释，取2～3个不同的稀释度，各在培养基上加0.1毫升，用灭菌三角推棒将水样在培养基上充分涂布，25～28℃培养24小时，观察或计数菌落。

2.水生动物病原微生物的分离培养

对怀疑由细菌感染引起的发病或死亡，通常可从肝、脾、肾、血液中取样进行细菌的分离，对表现出运动机能失调的疾病，也可从脑中分离细菌。体表和鳃组织，无菌水冲洗 3遍，用接种环挑取少量组织。体内器官组织，先用70%酒精将病鱼胸腹部进行大面积消毒，再用无菌水冲洗，从肛门附近剪开一个缺口，沿腹部左（右）测向上剪去胸腹壁脏器，70%酒精棉球消毒脏器表面，接种环穿刺挑取少量组织。体表溃疡症状的病鱼，其病灶处附近也是重要的取样和细菌分离处。

从病鱼分离细菌要求鱼体较为新鲜，最好是濒临死亡的病鱼，死亡半小时左右的鱼也可用于细菌分离。死亡时间太长的鱼，体内会有大量细菌生长，影响对结果的正确判定。高温季节鱼体送检时，尽量送表现明显症状的活鱼，也可用冰保持低温，以保证分析的准确性。对于肠道感染或已经污染的标本，可依据疾病的可能病原，采用选择性培养基进行病菌分离培养。

将接种环挑取的组织直接于液体增菌培养基进行扩增培养，25～37℃培养24小时，再取1接种环，划线接种于固体培养基上，25～37℃培养24～48小时。选取形状、色泽和大小一致的优势单菌落，重复划线分离培养，以获得纯种。

分离培养基、培养温度、培养时间依据不同的水生动物品种和分离菌种有一定差异。

八、注意事项

1.如何获得单菌落

单菌落是病原菌分离获得纯培养的基本保证，所有的细菌毒力或致病力测定、药敏试验、细菌鉴定都应当在挑取单菌落的基础上进行，特别是细菌鉴定时，更应对单菌落反复几次划线分离，挑取单菌落，以保证鉴定的准确性。获得单菌落的最基本方法是划线分离，常用的划线分离法步骤如下：①左手持培养皿，以左手拇指、食指及中指将皿打开20度左右的角度；②右手持接种环，从样品中取少许材料涂布于培养基边缘，将接种环上多余材料在火焰中烧毁；③接种环冷却后（也可在无细菌的边缘接触加快冷却），在首次所涂细菌的边缘轻轻接触，开始划线，注意不要划破培养基；④反复几次上一步骤，以保证分离样品充分稀释，获得单菌落。常见的划线方向见示意图。

当待分离的样品菌过浓，或从培养基菌苔上挑取菌落时，也可用挑取物在少量无菌水中适当稀释，再划线以保证获得单菌落。有些细菌，如变形杆菌，有较强的延伸或扩散生长能力，应及时挑取菌落，或加入适量的生长抑制剂，以保证获得单菌落。

2.难培养细菌的分离

难培养细菌有以下几种情况：①本身对营养要求较高，在常规培养条件下不易生长，可考虑加入血液、培养补充因子等，保证其生长，一般使用进口的脑心浸液可保证细菌生长；②生长较为缓慢，如分枝杆菌，则应延长培养时间；③培养条件不合适，如对于海水细菌，对盐度要求较高，则可在培养基中加盐，或为厌氧细菌在有氧条件下不能生长，则应采用厌氧条件下培养（有关方法可参考厌氧细菌的培养有关参考书）。

3.培养基的保存

配制好的培养基应立即灭菌后保存，制备好的固体培养基平板暂不使用时，应采用保鲜袋包好，以防培养基水份挥发，影响使用。液体培养基应保证瓶口密闭，以防止杂菌污染。加有抗生素的选择性培养基应4℃保存，以防止抗生素失效，达不到选择性效果。培养基使用前应仔细观察，如出现混浊、杂菌生长、变色、固体培养基干裂等情况，应重新配制。

4.细菌培养用器皿的灭菌及灭菌设备的选择

细菌培养用器皿的灭菌是细菌培养必须的手段。实验室常用的灭菌方法有干灭菌和湿热灭菌，专门的实验器皿生产单位还采用射线灭菌、化学灭菌等手段，后两者较为适合大量器皿的快速灭菌。此外，有些不耐热的培养基成份，只能采用过滤灭菌的方法

干热灭菌，干热灭菌是将待灭菌物品置于干烤箱中，使箱内温度上升到160℃，维持2小时以杀死物品中的一切微生物及其芽胞和孢子，高温可使微生物细胞结构破坏，核酸、蛋白质和酶变性，最终杀死微生物。细胞蛋白质凝固性与其本身及环境中含水量有关，含水量越大，蛋白质凝固越快。因此干热灭菌效果不如湿热灭菌。干热灭菌适合于试管、吸管、培养皿等玻璃器皿的灭菌，一次的灭菌量大。通常方法是160℃维持2小时，待箱内温度降至60℃后再打开箱门取出灭菌物品。干热灭菌时，灭菌温度不得超过180℃，以防止纸张和棉花等焦化起火。

湿热灭菌，即通常的高压蒸汽灭菌，将待灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，通常为0.1MPa（121.3℃）灭菌15～30分钟，可完全杀死灭菌物品的微生物和芽胞及孢子。采用此法灭菌时，应注意升压力前应通过排气阀尽量排尽冷空气，以保证灭菌时温度可达到121℃以上。本法适用于各种耐热培养基、试剂、玻璃器皿等物品的灭菌。

高压蒸汽灭菌锅的选择，高压锅分为立式、卧式和手提式几种，有不同的工作体积，一般实验室常用有15升、30升、50升等不同规格，可根据各自实验室的工作规模选择。目前已有可设定压力和灭菌时间的自动式高压锅，使用更为方便和稳定。一般国产高压灭菌锅已基本可满足实验需要，进口高压灭菌锅性能更为稳定，使用方便，且有防干烧保护装置，但价格基本在万元以上。

习题：

1.阐述鱼类寄生虫检测样品的采集与保存方法？

2.阐述病原微生物样品的采集与保存运输方法？

3.水生动物病样的取样原则和注意事项？

4.水生动物致病菌分离常用培养基有哪些？

5.微生物实验室常用物品的灭菌方法？

6.微生物实验室污染物品的处置方法？

7.养殖水体和水生动物病原微生物的分离培养方法？

8.培养基的保存方法？