重组质粒的酶切鉴定

实验八　重组质粒的酶切鉴定

一、实验目的

1.了解限制性内切酶的特性。

2.学会用琼脂糖凝胶电泳分析目的DNA片段的酶切图谱。

3.学会利用酶切图谱鉴定重组转化子。

二、实验原理

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。到目前为止，已分离出可识别230种不同DNA序列的Ⅱ型核酸内切酶达2 300种以上。限制性核酸内切酶的生理功能是在限制性核酸内切酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA被甲基化修饰，免受限制酶的降解。由于限制酶的发现与应用而导致体外重组DNA技术的发展，使人们有可能对真核染色体的结构、组织、表达及进化等问题进行深入的研究。

图3-5　HindⅡ酶切产生的平齐末端

目前已鉴定出三种不同类型的限制性核酸内切酶，其中Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程操作中最常用的内切酶，因为其具有特殊的识别和切割位点。

1970年由H.O.Smith和K.W.Wilcox发现的第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶被称作HindⅡ，它能将DNA从识别位点处切开，形成具有平齐末端的两段DNA（见图3-5）。与此相反，EcoRⅠ能在识别位点处将DNA切割成两条各含4个单链碱基的黏性末端。所谓黏性末端，是指含有几个核苷酸单链的末端，可通过这种末端的碱基互补，使不同的DNA片段发生退火（见图3-6）。

各种限制性内切酶都有其特定的识别和切割位

点。例如:

图3-6　限制性酶EcoRⅠ酶切产生的黏性末端及连接

EcoRⅠ酶识别和切割的顺序为:

EcoRⅠ:G｜AATTC

　　　 CTTAA｜G

NcoⅠ酶识别和切割的顺序为:

NcoⅠ:C｜CATGG

　　　GGTAC｜C

HindⅢ酶识别和切割的顺序为:

HindⅢ:A︱AGCTT

　　　 TTCGA︱A

由于HindⅢ酶是pMD19-T Vector上的单一酶切位点，并且是插入片段gfp上不存在的酶切位点，因此可以用HindⅢ进行单酶切，将质粒线性化，通过电泳与标准DNA对照，分辨出载体DNA和重组转化子DNA的大小。

另外，NcoⅠ和HindⅢ两个酶是插入片段gfp上引物两端人为设计的酶切位点，在载体pMD19Vector上不存在NcoⅠ位点，但有一个EcoRⅠ位点，因此利用这两个酶进行双酶切，若是重组转化子DNA，则可以切出3个片段，一个750bp左右的小片段为插入片段gfp，另一个2.7kb左右的大片段为载体，还有一个大约36bp的小片段，可以忽略不计。而未重组的质粒Pmd19Vector只能被酶切成2.7kb左右的大片段。

三、器材和试剂

水浴锅、微量移液器、移液器吸嘴、无菌1.5mL离心管、水平电泳槽、电泳仪、制胶槽、加样梳、凝胶成像仪、微波炉

质粒pMD19-T Vector，重组转化子DNA pMD-GFP，琼脂糖、1×TAE电泳缓冲液，6×DNA上样缓冲液，GoldViewTM核酸染料，DL2000DNA Marker，Lambda DNA/Eco130Ⅰ（StyⅠ）Marker，限制性内切酶EcoRⅠ，NcoⅠ，HindⅢ及其相应的10×酶切缓冲液

四、操作步骤

1.酶切反应

按顺序在无菌的1.5mL离心管中加入

单一酶切:

无菌去离子水　　　　　　　　 15.5μL

10×酶切缓冲液M　　　　　　　2μL

质粒Pmd-GFP/Pmd19Vector　　2μL

限制性内切酶HindⅢ　　　　　 0.5μL

双酶切:

无菌去离子水　　　　　　　　 11μL

10×酶切缓冲液　　　　　　　 2μL

10×BSA　　　　　　　　　　　2μL

质粒Pmd-GFP/Pmd19Vector　　4μL

限制性内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ各　0.5μL

盖紧上述4只离心管盖子，用手指弹几次使之混合均匀，在离心机上瞬时高速离心，使样品溶液集中到离心管底部。于37℃水浴锅酶解2h。

2.电泳检测

取上述4个样品的酶切反应物溶液各5μL以及两种DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪中观察酶切反应情况，分析酶切图谱。

五、实验结果与分析

1.单酶切图谱。

2.双酶切图谱。

3.重组转化子的测序图谱分析。

六、参考文献

［1］　〔美〕奥斯伯，等.精编分子生物学实验指南.4版.马学军，等译校.北京:科学出版社，2005.

［2］　〔美〕J.萨姆布鲁克，等.分子克隆实验指南.3版.黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008.