-金属螯合法纯化重组β-葡萄糖苷酶

一、目的要求

1．了解含His-tag的重组蛋白的特性。

2．学习Ni2+等过渡金属离子分离含His-tag的重组蛋白的原理。

3．熟练掌握Ni-NTA金属螯合法含His-tag的纯化重组β-葡萄糖苷酶的制备操作方法。

4．学习蛋白产品纯度的检验方法。

二、实验原理

蛋白表面的某些氨基酸残基如组氨酸的咪唑基团、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基团（后两种与金属离子的作用要小得多）可以与多种过渡金属离子如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+和Fe3+形成配位相互作用。因而，利用一些过渡金属离子能够吸附富含这类氨基酸的蛋白，可以通过改变盐的浓度等降低金属离子与蛋白的亲和力将其洗脱，从而达到分离纯化蛋白的目的。

利用镍离子（Ni2+）亲和柱分离纯化含组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白是蛋白分离的经典方法之一。蛋白过镍柱纯化的原理：在目标蛋白的N端或C端加入6个连续的组氨酸残基，形成含有6个His-tag的区段。利用每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和配体（填料）上的Ni2+带正电对组氨酸有亲和作用。在含His-tag的蛋白上样后，带有His-tag的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出，然后再用高浓度的咪唑梯度洗脱，咪唑竞争性结合到镍上，目标蛋白就被洗脱，收集洗脱液获得目标蛋白。

高亲和Ni-NTA纯化介质是把螯合剂NTA共价偶联到琼脂糖介质（4%交联）上，然后再螯合Ni2+制备而成。NTA能够通过4个位点牢固地螯合Ni2+，从而减少纯化过程中Ni2+泄漏到蛋白样品中。Ni-NTA纯化介质可以纯化任何表达系统（原核，酵母，昆虫细胞和哺乳动物细胞等表达系统）表达的天然或变性的 His-tag蛋白。结合在介质上的蛋白可以通过低p H缓冲液、咪唑溶液甚至组氨酸溶液洗脱下来。该实验所分离的蛋白是β-葡萄糖苷酶C端引入His-tag，因此，利用Ni-NTA纯化柱就能够选择性地纯化重组β-葡萄糖苷酶。

三、仪器与试剂

1．试剂

酵母提取物、胰蛋白胨、Na Cl、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、盐酸胍（Gu HCl）、卡那霉素、Na H2PO4、Tris、KCl、Na2HPO4•12H2O、KH2PO4、尿素（Urea）、溶菌酶、Ni-IDA树脂、Triton X-100、β–巯基乙醇、咪唑、HCl、乙醇。

2．仪器

培养箱、恒温摇床、超净工作台、超声破碎仪、高速离心机、三角瓶、聚苯乙烯层析柱、AKTA蛋白纯化系统（图3-10-1）、离心管、培养皿、烧杯、玻璃棒、封口膜。

图3-10 -1 AKTA蛋白纯化系统

四、实验操作与步骤

1．溶液配制

（1）Buffer A: 100 mmol/L Na H2PO4，10 mmol/L Tris，6 mol Gu HCl（p H 8.0）。

（2）Buffer B: 100 mmol/L Na H2PO4，10 mmol/L Tris，8 mol Urea（p H 6.3）。

（3）Buffer C: 100 mmol/L Na H2PO4，10 mmol/L Tris，8 mol Urea（p H 4.5）。

（4）PBS缓冲液: 称取Na Cl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4•12H2O 3.63 g，KH2PO40.24 g，溶于900 m L双蒸水中，用盐酸调p H值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。

2．细胞培养及β-葡萄糖苷酶的诱导表达

（1）将含有β-葡萄糖苷酶基因的BL21菌液接种到4 m L 含100 μg /m L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200 r/min振摇培养过夜。

（2）取100 µL培养过夜的菌液接种到5 m L含100 μg /m L卡那霉素的 LB液体培养液中，37℃，200 r/min振摇培养至OD600至0.6～0.8 h，加入1 mol的IPTG，使IPTG终浓度分别为使IPTG终浓度分别为1 mmol/L，置37℃摇床继续培养4 h，置4℃保存备用。

3．β-葡萄糖苷酶纯化

（1）收集3 m L菌液，10 000×g，4℃，离心5 min；1×PBS漂洗后离心收集沉淀。

（2）加入1×PBS，p H8.0（含有2%Triton X-100），振荡混匀后加入溶菌酶，在4℃反应30 min。

（3）菌体用超声破碎仪作用 10 min，随后在 10 000×g，离心 10 min，收集包涵体沉淀。

（4）加入200 µL Buffer A，0.5 μL β-巯基乙醇和4 μL咪唑（终浓度为20 mmol/L）。轻微混匀后，在室温放置1 h，使包涵体充分溶解。

（5）12 000×g，离心10 min，上清置于新的离心管中备用。

（6）取 50 μL 混合 50%乙醇的 Ni-NTA，轻微离心后，吸去上清，Ni-NTA 用等量的Buffer B洗涤两次。

（7）把包涵体破碎后的上清，加入到Ni-NTA中，室温轻微混匀30 min。

（8）12 000×g，离心10 s沉淀Ni-NTA，去上清。

（9）在Ni-NTA中加入250 μL Buffer B，和5 μL咪唑（终浓度为20 mmol/L），轻微混匀后，12 000×g，离心10 s，去上清。重复一次。

（10）加入25 μL Buffer C，和5 μL咪唑（终浓度为160 mmol/L），12 000×g，离心10 s，上清为含重组蛋白的洗脱液，重复三次。

（11）SDS-PAGE分析鉴定表达产物的分离纯化情况。

4．实验结果与分析

（1）拍照，记录实验结果。

（2）根据Marker蛋白条带分析目标蛋白大小，并分析是否形成二聚体或包涵体。

五、实验说明

（1）工程菌的构建与诱导表达时间要严格控制，通常在OD=0.6左右进行诱导表达。

（2）蛋白的纯化尽量在16℃以下的环境温度操作。

（3）注意Ni-NTA的再生条件。

六、思考题

1．为何要用ITPG诱导蛋白得以表达？

2．实验中使用的几种缓冲液起什么作用？

3．实验中有时候流速很慢，分析其可能的原因。

4．目标蛋白不能与Ni-NTA树脂结合，试分析其原因。

5．目标蛋白洗脱失败或洗脱液中含有杂蛋白，试分析其原因。