阳性重组子的鉴定

阳性重组子的筛选与鉴定是分子克隆实验中经常遇到的一个重要问题。当DNA片段连接产物转化感受态大肠杆菌后经相应抗生素抗性粗筛后，还需要进一步确认是否是阳性重组子，才能继续进行后续的实验研究。目前常采用的筛选和鉴定阳性重组子方法有：①蓝白斑筛选；②菌落PCR或通过特异探针从菌落原位杂交筛选；③通过提取质粒DNA，依据分子量大小及酶切图谱进行鉴定；④提取质粒后，进行序列测定。

一、初步鉴定：蓝白斑筛选

（一）基本原理

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种常用方法，是根据载体的遗传特征来筛选阳性重组子。基本原理是目前构建的许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中包括β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，表达产物为无活性的酶的一部分（α-肽）。此类载体的宿主菌在其染色体DNA上仅带有β-半乳糖苷酶C端部分序列，表达产物为无活性的酶的另一部分（ω-肽）。虽然宿主细胞和质粒载体编码的片段都没有酶活性，但它们同时存在时，无论在细胞内还是细胞外，两片段都可结合形成具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白质，这种作用即称为α-互补。由α-互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，可使生色底物X-gal由白色生成蓝色的化合物，从而产生蓝色菌落。

通常在此类载体lacZ基因的编码区中插入了一个多克隆位点（multiple cloning site，MCS），可在此MCS处插入外源的目的基因片段。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，破坏了质粒中β-半乳糖苷酶基因的N端编码序列，从而无法形成具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白质，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选称为蓝白斑筛选。

需注意的是，蓝白斑筛选仍然只是一种初筛，得到的蓝斑不一定都是空载体菌落，白斑也不一定就都是阳性重组子。因为如果插入的外源目的基因片段较短，且碱基数刚好为3的倍数，插入的位置又没有破坏lacZ基因的读码框，就有可能不会影响β-半乳糖苷酶的活性，从而产生蓝色菌落。而有的白斑有可能是载体自连的假阳性，或是操作时Amp、IPTG和X-gal其中一种或几种没涂均匀，从而产生白色菌落。

（二）结果与分析

1．实验结果及分析 将连接产物转化感受态细胞后接种于涂布有IPTG和X-gal的筛选平板上，经37℃温箱倒置培养12～16h，含有成功插入外源目的基因的阳性重组质粒的细菌就会形成白色菌落，而仅有空载体插入的细菌就会形成蓝色菌落。在接种了细菌的平板上，可看到有大量的菌落生长，分布比较均匀，且有蓝斑和白斑出现（图8-8）。

图8-8 蓝白斑筛选结果图（见彩图）

2．常见问题及解析 见表8-4。

表8-4 蓝白斑筛选常见问题及解析

(续表)

（三）IPTG与X-gal介绍

IPTG，即Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid，也称Isopropyl -β-D-thiogalactoside，中文名为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。它的结构与乳糖操纵子的诱导物半乳糖非常相似，诱导效率远大于半乳糖，因此在实验室中常用作具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物。在阳性重组子的筛选中常用于蓝白斑筛选。

X-gal，中文名为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。X-gal是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会生成蓝色产物，常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。

IPTG配制成24mg/ml（100mmol/L）的水溶液，过滤除菌后保存。使用终浓度为0.02mg/ml 。

X-gal用二甲基甲酰胺（DMF）溶解后配制成20mg/ml的储存液，无须过滤除菌。但X-gal易光解，需避光储存于－20℃。使用终浓度为0.04mg/ml。

二、明确鉴定

对阳性重组子进行蓝白斑初筛后，为了进一步确认阳性结果，我们还需要进行更准确的鉴定，如菌落PCR，提质粒、酶切，序列测定等。

（一）菌落PCR

【基本原理】 菌落PCR（Colony PCR）是一种快速鉴定阳性重组子的方法，可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，从而鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。其与普通DNA的PCR反应的不同在于可直接以单个菌作为模板，操作简单，快捷，阳性率较高，在转化鉴定中应用广泛。

【操作步骤】

【注意事项】

（1）上述步骤中挑取菌体时，可在LB琼脂糖平板上轻点一下，做一拷贝；也可以不点板，直接接种摇菌，如用1.5ml的EP管装1ml左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌，然后再放到PCR反应体系中。这样早上做PCR，下午就可以提质粒鉴定。

（2）如果觉得挑菌做模板不可靠，还可以热裂解细菌后做模板。如取菌液60μl至EP管中，沸水中煮5min，离心，取上清1μl作模板。

（3）当PCR扩增条带很亮时，基本上都是真阳性，但如果PCR扩增产物似有似无，比较淡，假阳性的可能性比较大。为避免假阳性的出现，引物设计很重要，建议两个引物一个为目的基因一个为载体上的。这样一般可以降低假阳性。当然提质粒酶切鉴定一下更好。

（二）质粒提取及酶切鉴定

【基本原理】 质粒的分离提取是分子生物学实验中最常用、最基本的实验技术之一。质粒提取分离的方法很多，最常用的是碱裂解法提取质粒。

碱裂解法提取质粒的基本原理是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和变性复性的差异来进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子易断，经碱处理后容易变性并产生沉淀。即使碱性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。而质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因碱处理等被拆开，恢复中性pH后又呈天然构型，溶解在溶液中。这样通过碱处理后又中和pH，再用离心的方法就可把质粒 DNA提取出来。

限制性内切酶是DNA操作过程中使用的基本工具。限制内切酶特异性地结合于一段被称为限制内切酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA，形成黏性末端或平末端。

阳性重组子的构建通常是应用限制性内切酶将载体切开后连接上外源目的基因片段，因此，在阳性重组子的鉴定中，我们也可以利用此性质，将外源目的基因片段用限制性内切酶切下来，从而证实有外源目的基因片段的插入。

【操作步骤】

具体实验步骤如前章所述。

（三）序列测定

1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定。20世纪70年代后期，Sanger建立了双脱氧末端终止法，Maxam-Gilbert建立了化学裂解法。这些方法和技术的出现将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，人们可以准确了解目的基因的碱基序列，极大促进了生命科学的发展。

在阳性重组子的鉴定中，蓝白斑筛选是简单的初筛，确切的鉴定需要进一步进行PCR和酶切，但最终仍应进行序列测定，并以测序的结果为准。

【基本原理】 在4种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列被放射性核素或荧光染料标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影或激光激发，即可直接读出DNA的序列。

【操作步骤】

目前，由于DNA测序仪的不断进步和普及，自动化的测序已是主流方法。当实验中需要进行序列测定时，实验者需要准备的和提供给测序人员的仅是序列的质粒或PCR产物。测序反应实际也是PCR反应，但与普通PCR不同的是，需要掺入荧光物质，因此测序反应和后续纯化反应通常由测序人员完成（具体内容参见第10章）。

（周珏宇 冯春琼）