重组聚合酶链式反应检测缺点

实验项目二十　聚合酶链反应技术

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述聚合酶链反应技术的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述聚合酶链反应的实验操作要点。

（3）能够准确鉴定聚合酶链反应的结果，并能说明其意义。

【能力目标】

（1）能够正确完成聚合酶链反应技术的各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够清楚聚合酶链反应实验项目的操作有哪些注意事项。

（3）能够正确分析聚合酶链反应技术的结果。

案例引导

患者，男，46岁，近段时间感到乏力、体力不支，容易疲劳，打不起精神，出现食欲不振、恶心、厌油、上腹部不适、腹胀等症状。“两对半”检查：HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋），HBV－DNA检测阳性，根据所学知识作出诊断。

（提示：乙型肝炎）

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，简称PCR）技术诞生于1985年，它是根据生物体体内DNA复制的某些特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速扩增的一项新技术。随着热稳定性Taq DNA聚合酶的应用和自动化热循环仪的设计成功，PCR技术的操作程序大大简化，并且广泛地应用于基因研究的各个领域。

【实验原理】

聚合酶链反应是在模板DNA、一对引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术有两个重要特性，一是能合成DNA的特定序列，二是特定序列的大量扩增。模板可来自组织细胞提取的DNA、mRNA反转录得到的cDNA或人工合成的DNA。两段寡核苷酸引物序列各不相同，它们分别与模板DNA两条链上3端一段20bp左右的序列互补。寡核苷酸引物用自动DNA合成仪合成。目前，在PCR体系中使用较广泛的是热稳定性聚合酶。该酶最初是从美国黄石国家公园的温泉中发现的，由于其最适温度为72℃，因此不会在加热变性的步骤中失活，无须在每轮反应中都重新加酶，从而简化了PCR操作，增加了PCR特异性。PCR反应体系中的4×dNTPS（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）提供靶DNA序列扩增的原料。

PCR可分为三步。①变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA。②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构比引物要复杂得多，并且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸：在四种脱氧核苷三磷酸底物及Mg^2＋存在条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸，在模板DNA链上形成两条新链。以上三步为一个循环，每一个循环的产物可作为下一次循环的模板，数小时后，介于两引物之间的特异DNA片断得到大量复制，数量可达2×10^6～7拷贝。

【实验器材】

DNA扩增仪（可用3个恒温水浴箱代替）。

【药品及试剂】

明胶，KCl，MgCl₂，4×dNTPS混合物模板DNA，Taq DNA聚合酶（5U/μL），轻矿物油，引物。

【试剂配制】

（1）10×扩增缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris－HCl（pH＝8.3，室温下），15mmol/L MgCl₂，0.1%明胶。

（2）4×dNTP混合物，每种混合物浓度为1.25mmol/L。

（3）引物1（溶于5μL水）。

（4）引物2（溶于5μL水）。

（5）模板DNA：因反应中Mg^2＋的最适浓度很低，故用做模板的DNA应溶于10 mmol/L Tris－HCl（pH＝7.6）和0.1mmol/L EDTA（pH＝8.0）中。

操作流程

【操作步骤】

（1）按以下顺序，将各成分在0.5mL灭菌离心管内混合。

灭菌双蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　30μL

10×扩增缓冲液　　　　　　　　　　　　　　　　　10μL

4×dNTP混合物（每种浓度为1.25mmol/L）　　　　　 16μL

引物1（溶于5μL水）　　　　　　　　　　　　　　 100pmol

引物2（溶于5μL水）　　　　　　　　　　　　　　 100pmol

模板DNA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.1～2μg

加蒸馏水至终体积　　　　　　　　　　　　　　　　100μL

（2）在94℃时加热反应混合液5min，使DNA完全变性。

（3）将0.5μL Taq DNA聚合酶加入仍处于94℃的反应混合液中。

（4）用100μL轻矿物油覆盖在反应混合液上，防止样品在以后的循环过程中蒸发。

（5）按以下方法进行扩增，典型的变性、退火和延伸条件如表3－30所示。

表3－30　典型的变性、退火和延伸条件

循环共进行30次，循环中每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。末轮循环后不再变性，样品在－20℃条件下保存。

（6）从反应混合液中取出DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。如有必要，可用150μL氯仿抽提样品以除去矿物油。

【实验数据处理及结果分析】

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

【注意事项】

（1）PCR反应缓冲液及混合dNTP不宜反复冻融，否则会降低效率，影响DNA扩增。

（2）模板DNA一般在最后加入，以防止交叉污染，否则污染DNA同样被扩增，从而出现假阳性结果。Eppendorf管及吸头最好一次性使用。

【实验意义】

由于PCR技术具有特异、高效、快速、简便等特点，所以在分子生物学等诸多领域都有广泛的应用。

PCR技术可以用于DNA的克隆。在法医学上，PCR技术常用于个人识别及亲子鉴定。利用PCR还可以对一些遗传相关疾病的基因进行检测。在古生物学上，对于从古生物化石上提取的DNA进行扩增并分析，对研究古生物遗传也有重要意义。

能力检测

一、单项选择题

1.PCR技术扩增DNA需要的条件是（　　）。

①目的基因　②引物　③四种脱氧核糖核苷酸　④DNA聚合酶等　⑤mRNA

⑥核糖体

A.①②③④　　B.②③④⑤　　C.①③④⑤

D.①②③⑥　　E.①②④⑤

2.镁离子在DNA体外扩增反应的浓度一般为（　　）。

A.0.3～1mmol/L　　B.0.5～1mmol/L　　C.0.3～2mmol/L

D.0.5～2mmol/L　　E.1～2mmol/L