血清胆红素浓度测定

血清胆红素浓度测定_生物化学实验技术

实验项目九　血清胆红素浓度测定

学习目标

【知识目标】

（1）能够迅速而准确地描述出血清胆红素浓度测定的操作要点。

（2）能用自己的语言描述血清总胆红素、结合胆红素浓度的正常范围。

【能力目标】

（1）能在规定时间内正确完成血清总胆红素、结合胆红素浓度测定的各项操作内容，做到步骤正确、连贯、内容全面。

（2）能通过血清总胆红素的浓度检测结果判定隐性黄疸、显性黄疸。

（3）能够综合血清总胆红素浓度、结合胆红素浓度检测结果诊断黄疸，并判断黄疸类型。

案例引导

患儿，男，出生32d，纯母乳喂养，因腹胀、呕吐、腹泻，皮肤、巩膜较黄，尿和粪颜色改变前来就诊。体格检查：无肝掌和蜘蛛痣；淋巴结未见肿大；肝功能化验，总胆红素：315.2μmol/L，结合胆红素：5.1μmol/L。请初步诊断该患儿为何种病？

（提示：新生儿黄疸）

一、血清总胆红素浓度测定

【实验原理】

胆红素是由四个吡咯环组成的复杂分子。在体内大部分来自于衰老的红细胞的血红素降解，少部分来源于肌红蛋白、细胞色素P 450、过氧化物酶等的血红素辅基分解。极少部分来自于在造血过程中骨髓部位破坏的未成熟红细胞。血液中的胆红素从结构上可分为：游离（未结合）胆红素、结合胆红素和D胆红素（delta－胆红素）。其中，D胆红素为清蛋白与胆红素共价结合后的一种特殊结合胆红素，它不同与正常条件下的结合胆红素，在健康人的血清中检测不出，只能在高胆红素血症或前期血液胆红素浓度较高的患者体内检测出。

临床上常用测定血清总胆红素含量、结合胆红素含量，以及两者比值来判断黄疸程度及鉴别黄疸类型。临床上检验血清总胆红素常用的方法有重氮法、钒酸盐法、胆红素氧化酶法等。IFCC（国际临床化学联合会）推荐目前总胆红素测定采用重氮法。1883年，Ehrlich发明重氮试剂并将其应用于尿中胆红素的测定。1916年，Van den Bergh将重氮试剂应用于血清中胆红素的测定。血清胆红素测定的经典方法是1938年Jendrassik和Grof报告的方法，又称J－G法。1985年，美国临床化学学会公布改良J－G法为胆红素测定的参考方法。由于改良J－G法测定步骤较多，不适合进行自动分析。

最近又出现了一种新的重氮法，在重氮胆红素生成后直接进行比色，操作简单，试剂稳定，适合进行自动化分析。其原理如下：在pH值为6.5的酸性介质中，血清中的结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素。在破坏氢键的试剂（如甲醇、乙醇、尿素、苯甲酸钠、咖啡因、乙酸钠、表面活性剂等）作用下，破坏了游离胆红素的氢键，使胆红素分子的亲水基团参与偶氮反应，也产生紫红色偶氮胆红素。这样，检测出的是游离和结合胆红素二者的总和（也可能含有D胆红素），称为总胆红素。叠氮钠（或抗坏血酸）可终止结合胆红素的偶氮反应。偶氮胆红素在546nm处有最大吸收峰，颜色的深浅与胆红素的浓度呈正比，通过比色法测定出血样总胆红素浓度。

【实验器材】

半自动生化分析仪，微量加样器，恒温水浴箱，试管，试管架。

【药品及试剂】

（1）新鲜血清。

（2）商品试剂盒供应，其主要成分与实验浓度如表3－19所示。

表3－19　重氮法检测血清总胆红素浓度某试剂盒的主要成分与实验浓度

【试剂配制】

现在多用现成的试剂盒，方便、实用，既适用于手工操作，也适用于自动分析仪。

操作流程

【操作步骤】

1.工作液配制

将R₁与R₂以5∶1的比例混合，配制成工作液。

2.半自动生化分析仪设置

根据各实验室仪器的型号及操作说明书进行半自动生化分析仪的设置。

设置步骤为参数设置→反应液准备→校准→质控。

3.显色反应

取干净试管3支，做上标记，按表3－20重氮法检测血清总胆红素浓度操作步骤进行操作。

表3－20　重氮法检测血清总胆红素浓度操作步骤（单位：mL）

4.比色测定

分别混合均匀，在37℃时保温10min，以试剂空白管校零，在546nm处有最大吸收峰，终点法，利用半自动生化分析仪测定。（在60min内吸光度保持不变）。

【实验数据处理及结果分析】

如通过检测的吸光度值A计算，则

【注意事项】

（1）胆红素对光敏感，标本应避光保存。

（2）严重溶血可使结果偏低。

（3）叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。

（4）本法不受温度影响，呈色在2h内稳定。

（5）标本量少时可不做标本标准管，可参照其他标本标准管的吸光度值。

（6）由于胆红素遇光易分解为胆绿素，因此采血后应尽快进行测定，如果不能及时测定，血清应避光冷冻保存。

（7）若R₂变黄，则不能使用。

（8）所有玻璃器皿必须干净，没有污染。

（9）试剂盒应在2～8℃条件下储存，避免在8℃以上及0℃以下存放。

【实验意义】

1.正常值

健康成年人血清总胆红素浓度为3.4～17.1μmol/L（或参考试剂盒提供的参考范围）。

2.意义

胆红素是红细胞正常或非正常降解后在内皮系统形成的有机复合物，检测胆红素浓度不仅有利于监测肝脏疾病，还可发现溶血性贫血以及评估黄疸的程度，它一直是重要的常规肝功能检测指标。

（1）判断有无黄疸：血清总胆红素测定对诊断黄疸及判断黄疸程度有非常重要的意义。若总胆红素浓度为17.1～34.2μmol/L时称为隐性黄疸；若总胆红素浓度大于34.2μmol/L时，皮肤、黏膜、巩膜出现黄染，称为显性黄疸。

（2）血清总胆红素浓度升高常见于下列疾病：①胆红素形成过高，如溶血性黄疸。②肝细胞处理胆红素的能力下降，如肝细胞黄疸。③胆红素在肝外的排泄障碍，逆流入血而引起的黄疸，如阻塞性黄疸。④新生儿溶血症，血清总胆红素浓度测定有助于了解疾病的严重程度。

（3）血清总胆红素浓度降低常见于下列疾病：再生障碍性贫血及数种继发性贫血（主要见于癌症或由慢性肾炎引起）、癌症或慢性肾炎所致的继发性贫血时，血清总胆红素浓度可见降低。

二、血清结合胆红素浓度测定

【实验原理】

肝、脾、骨髓等单核吞噬细胞系统将衰老的和异常的红细胞吞噬，分解血红蛋白，生成和释放出的胆红素不与葡萄糖醛酸等结合，故称为游离（未结合）胆红素。游离胆红素不能直接与重氮试剂反应，因此也可称为间接胆红素。胆红素在肝细胞内与葡萄糖醛酸结合后称为结合胆红素。结合胆红素可以直接与重氮试剂反应，故也称为直接胆红素。

样本中的结合胆红素在酸性条件下，与重氮盐反应，形成偶氮胆红素，在分光光度计546nm波长下测定。其值与结合胆红素含量呈正比。

【实验器材】

半自动生化分析仪，微量加样器，恒温水浴箱，试管，试管架。

【药品及试剂】

（1）新鲜血清。

（2）有商品试剂盒供应，其主要成分与实验浓度如表3－21所示。

表3－21　重氮法检测血清结合胆红素浓度某试剂盒的主要成分与实验浓度

【试剂配制】

现在多用现成的试剂盒，方便、实用，既适用于手工操作，也适用于自动分析仪。

操作流程

【操作步骤】

1.工作液配制

将R₁与R₂以40∶1比例混合，配制成工作液。

2.半自动生化分析仪设置

根据各实验室仪器的型号及操作说明书进行半自动生化分析仪的设置。

设置步骤为参数设置→反应液准备→校准→质控。

3.显色反应

取干净试管3支，做上标记，按表3－22的重氮法检测血清结合胆红素浓度操作步骤进行操作。

表3－22　重氮法检测血清结合胆红素浓度操作步骤（单位：mL）

4.比色测定

将溶液分别混合均匀，在37℃条件下保温5min，以试剂空白管校零，在546nm处有最大吸收峰，终点法，利用半自动生化分析仪测定。（在60min内吸光度保持不变）。

【实验数据处理及结果分析】

如用通过检测的吸光度值A计算，则

【注意事项】

（1）由于胆红素遇光易分解为胆绿素，因此采血后应尽快进行测定，如果不能及时测定，血清应避光冷冻保存。

（2）应避免溶血，一旦溶血时可能会出现结果为负值。

（3）R₂应避光保存，R₂变黄则不能使用。

【实验意义】

1.正常值

健康成年人血清结合（直接）胆红素浓度为0～6.8μmol/L（或参考试剂盒提供的参考范围）。

2.意义

检测胆红素含量有利于监测肝脏疾病、发现溶血性贫血以及评估黄疸的程度。血清结合胆红素与总胆红素浓度的比值可用于鉴别黄疸类型。

（1）比值小于20%，总胆红素浓度升高，结合胆红素浓度正常或稍升高，提示为溶血性黄疸。当体内有大量红细胞破坏时，未结合胆红素含量增加，使血中含量增高，由于未结合胆红素不能通过肾，故尿胆红素试验呈阴性。未结合胆红素含量增加，导致肝细胞代偿性产生更多的结合胆红素。当将其排入肠道后转变为粪胆原的量又增多，因而肠道吸收粪胆原及由尿中排出尿胆原的量均相应增加，尿胆原试验呈明显阳性。阵发性血红蛋白尿、恶性贫血、红细胞增多症、严重大面积烧伤等可能导致溶血性黄疸。

（2）比值为40%～60%，总胆红素及结合胆红素浓度均升高，提示为肝细胞性黄疸。肝细胞损伤时其对胆红素的摄取、结合、排除功能均可能受损。由于肝细胞摄取血浆中未结合胆红素能力下降故使其在血中的浓度升高，所产生的结合胆红素又可能由于肝细胞肿胀、毛细胆管受压，而在肿胀与坏死的肝细胞间弥散，经血窦进入血液循环，导致结合胆红素浓度升高，因其可溶于水并经肾排出，使尿胆红素试验呈阳性。此外，经肠道吸收的粪胆原也因肝细胞受损而不能将其转变为胆红素，而以尿胆原形式由尿中排出，故肝细胞黄疸时尿胆红素与尿胆原均呈明显阳性。

（3）比值大于60%，总胆红素浓度及结合胆红素浓度均升高，但以结合胆红素浓度升高为主，则提示为阻塞性黄疸。胆汁淤积使肝胆管内压增高，从而导致毛细胆管破裂，结合胆红素不能排入肠道而逆流入血再由尿中排出，故尿胆素检查呈阳性。由于胆汁排入肠道受阻，故尿胆原含量减少。如果是胆石症，尿胆原可呈间歇性减少或消失；如果为肿瘤压迫所致，尿胆原可进行性减少或消失。

（4）结合胆红素含量升高而总胆红素含量几乎不变时，可见于病毒性肝炎前期、无黄疸型肝炎、胆道部分阻塞或肝癌。

能力检测

一、单项选择题

1.正常人血清中的胆红素主要是（　　）。

A.结合胆红素　　　　　　　B.未结合胆红素

C.与珠蛋白结合的胆红素　　D.游离胆红素

E.δ－胆红素

2.血清胆红素测定的标本必须避免阳光直接照射，以免结果降低，其原因是（　　）。

A.胆红素易氧化为胆绿素　　　　　　B.胆红素分子构型改变

C.直接胆红素易转变成间接胆红素　　D.胆红素分解

E.形成δ－胆红素

3.未结合胆红素不溶于水，不能与重氮试剂发生直接反应，其关键原因是（　　）。

A.与葡萄糖醛酸结合，故不溶于水

B.与清蛋白结合使亲水基团包含在内

C.有分子内氢键形成，故不溶于水

D.与球蛋白结合使亲水基团包含在内，故不溶于水

E.处于游离状态

4.血清总胆红素含量在下列哪个范围内为隐性黄疸？（　　）

A.3.4～17.1μmol/L　B.17～34μmol/L　　C.34～170μmol/L

D.170～340μmol/L　　 E.0～6.8μmol/L

5.在胆红素临床研究中还观察到（　　）。

A.胆红素在急性肝炎和严重肝病时浓度升高

B.胆红素在急性肝炎和严重肝病时浓度降低

C.胆红素在急性肝炎恢复期浓度升高，严重肝病时浓度降低

D.胆红素在急性肝炎恢复期浓度降低，严重肝病时浓度升高

E.胆红素在急性肝炎恢复期和严重肝病时浓度都升高