实验项目六 血清总胆固醇浓度测定
学习目标
【知识目标】
（1）能够迅速而准确地陈述血清总胆固醇浓度检测操作要点。
（2）能用自己的语言描述硫磷铁化学显色法及胆固醇氧化酶法检测血清总胆固醇浓度的原理。
【能力目标】
（1）能在规定时间内正确完成血清总胆固醇浓度检测的各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。
（2）能够鉴别血清总胆固醇浓度结果，并能举例说明其临床意义。
（3）能够理解利用手工比色分析与自动比色分析的异同。
案例引导
患者，女，25岁，在体格检查中检测到血清总胆固醇浓度为9.0mmol/L，甘油三酯浓度为1.79mmol/L，血样透明，两手有腱黄瘤，血压为16.0/9.3kPa。其父40岁时因缺血性心脏病做过冠状动脉分流术，其哥哥现30岁，总胆固醇浓度为13.0mmol/L。请说出其可能患有何种病，并说明原因。
（提示：家族性高胆固醇血症）
胆固醇是人体的主要固醇，是非饱和固醇，基本结构为环戊烷多氢菲的衍生物，主要在体内合成，另有一部分直接从食物中摄取。它不仅是血浆脂蛋白的组成成分，而且也是细胞的必要结构成分，另外还可以转化成胆汁酸盐、某些类固醇激素（如性激素、肾上腺皮质激素等）和维生素D等。血液中的胆固醇仅有不到20%是从食物中摄取的，其余均由机体自身合成，肝、肠、肾、骨髓及内分泌腺等均是合成场所。由于血液与组织内的胆固醇经常不断地交换，因此血清胆固醇水平基本能够反映胆固醇的摄取、合成及转运情况。胆固醇在体内以游离胆固醇及胆固醇酯两种形式存在，统称为总胆固醇，其中胆固醇酯占70%～75%。血清胆固醇测定是动脉粥样硬化性疾病防治、临床诊断和营养研究的重要指标，据国外报道体内胆固醇长期偏低，是诱发癌症的因素之一。因此，血清总胆固醇的测定是临床最普遍检测项目之一。
血清总胆固醇的测定方法目前已超过200种，可分为化学比色法、酶分析法、荧光法、气相色谱法和高效液相色谱法等五大类。由于气相色谱法和高效液相色谱法条件高，临床实验室最常用的是化学比色法和酶分析法。
一、硫磷铁化学显色法
【实验原理】
化学比色法一般包括抽提、皂化、纯化、显色、比色五个阶段。化学比色法测定总胆固醇的比色原理主要分以下三类。①胆固醇与醋酐－硫酸试剂反应产生蓝绿色产物。胆固醇酯和胆固醇在与醋酐－硫酸反应后，呈色深浅不同，因此用这种方法测定结果偏高。②胆固醇与高铁－硫酸试剂反应产生紫红色产物。高铁－硫酸比色法灵敏度高，显色稳定，测定精密度好，是临床上检验胆固醇推荐的方法，但干扰因素多。③胆固醇与邻苯二甲醛－硫酸试剂反应产生稳定的紫红色产物。邻苯二甲醛－硫酸比色法不需要对胆固醇进行抽提而直接进行测定。
本实验采用硫磷铁化学显色法。用无水乙醇抽提血清中的胆固醇，同时使蛋白质沉淀。然后在乙醇提取液中加入硫磷铁显色剂，使胆固醇及其酯与浓硫酸及三价铁作用，生成紫红色化合物，此物质在550nm波长处有最大吸收峰，其显色程度（颜色深浅）与胆固醇浓度（含量）呈正比。因此，可用比色法作总胆固醇的定量测定。将血清样本与同样处理的标准液进行比色，即可求出总胆固醇的含量。本法颜色产物比较稳定。
【实验器材】
试管及试管架，刻度吸量管或移液器，离心机，722型分光光度计，恒温水浴箱。
【药品及试剂】
血清，胆固醇标准储存液，胆固醇标准应用液，铁储存液，显色液，浓硫酸，无水乙醇。
【试剂配制】
1.胆固醇标准储存液
精确称取干燥重结晶胆固醇100mg，溶于无水乙醇内（稍加温助溶），然后移入100mL容量瓶中，加无水乙醇至所需刻度，储存于棕色瓶中，密塞瓶口置于4℃冰箱内保存。配制胆固醇标准应用液时，应将其预先恢复至室温。
2.胆固醇标准应用液
取上述储存液5mL置于100mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，再加蒸馏水2 mL，储存于棕色瓶内，放置在冰箱中保存，用时再将其恢复至室温。
3.铁储存液
称取三氯化铁晶体（FeCl3·6H2O）2.5g溶于87%浓磷酸内，并加至100mL，储存于棕色瓶中。此液在室温条件下可长期保存。
4.显色液
取铁储存液8mL，加浓硫酸至100mL，此液在室温条件下可保存6～8周。
操作流程
【操作步骤】
1.提取液制备
准确吸取血清0.10mL，置入干燥的试管中，对准血清吹入无水乙醇2.9mL，抽提胆固醇，同时使蛋白质分散成细小的沉淀，用力振荡约10s，放置5min，再次摇匀沉淀，以2000r/min的转速离心约10min，吸取上清液（即抽提液）置于另一支干净试管中备用。
2.显色反应
取干燥试管3支，分别标记。按表3－7进行用硫磷铁化学显色法检测血清总胆固醇浓度显色反应的操作步骤。
表3－7 硫磷铁化学显色法检测血清总胆固醇浓度显色反应操作步骤（单位：mL）
3.比色测定
显色液加毕，每加完一管试剂，立即振摇15～20次，置于室温下冷却15min，然后在550nm波长处比色，以空白管调零点，测出各管吸光度值A。
【实验数据处理及结果分析】
【注意事项】
（1）离心后上清液必须清亮透明，不能混有细微沉淀颗粒，否则要重新离心。
（2）显色反应与加显色液后混合时的产热程度有关，因此在操作中应注意：①加入的显色液必须与乙醇分成两层，可稍后混合，不能边加边摇，否则显色不完全；②显色液要加一管混合一管，混合的手法也要一致；③实验过程中涉及浓硫酸、浓磷酸，混合时会导致试管发热，且注意勿使管内液体溅出，以免损伤衣服、皮肤、眼睛。
【实验意义】
1.正常值
正常空腹静脉血清胆固醇浓度为2.9～6.0mmol/L。
2.意义
参见胆固醇氧化酶法实验意义。
二、胆固醇氧化酶法（COD－PAP法）
【实验原理】
酶分析法是目前常规检测血清胆固醇的应用方法，其优点是快速准确、专一性强、样本用量少、不需抽提，便于自动化分析和批量测定，是中华医学会检验学会推荐的胆固醇测定的常规方法。
血清中的胆固醇约1/3为游离胆固醇，2/3为与脂肪酸结合的胆固醇酯。血清中胆固醇酯可被胆固醇酯水解酶（CEH）水解成游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA）。胆固醇被胆固醇氧化酶（COD）氧化成Δ4－胆甾烯酮，并产生过氧化氢，再经过氧化物酶（POD）催化，使H2O2与4－氨基安替吡啉、酚（三者合称PAP）反应，生成红色苯醌亚胺（Trinder反应）。苯醌亚胺在波长为500nm左右有最大光吸收峰，其显色程度（颜色深浅）与总胆固醇浓度（含量）呈正比。因此，血清样本与同样处理的标准液进行比色，即可求出总胆固醇的含量。
反应式如下：
【实验器材】
试管，试管架，微量加样器，半自动生化分析仪，记号笔，恒温水浴箱。
【药品及试剂】
（1）新鲜无溶血血清。
（2）商品试剂盒供应，其主要成分与实验浓度如表3－8所示。
表3－8 胆固醇氧化酶法检测血清总胆固醇浓度某试剂盒的主要成分与实验浓度
【试剂配制】
现在多用现成的试剂盒，方便、实用，既适用于手工操作，也适用于自动分析仪。
操作流程
【操作步骤】
1.手工测定操作步骤
取干燥试管3支，分别标记。按表3－9进行胆固醇氧化酶法检测血清总胆固醇浓度手工测定的操作步骤。
表3－9 胆固醇氧化酶法检测血清总胆固醇浓度手工测定操作步骤（单位：μL）
各管摇匀，置于37℃恒温水浴箱中5min，分光光度计波长为500nm，比色杯光径为1cm，以空白管调零，读取各管吸光度值A。
2.自动分析操作步骤
反应模式：终点法。反应温度：37℃。测定波长：500nm。
取一定量R2（参看R1瓶签）复溶1瓶R1，溶解后即为工作液。取干燥试管3支，分别标记，按表3－10进行胆固醇氧化酶法检测血清总胆固醇浓度自动分析的操作步骤。
表3－10 胆固醇氧化酶法检测血清总胆固醇浓度自动分析操作步骤（单位：mL）
分别混匀，在37℃恒温水浴箱中保温6min，以空白管调零，读取浓度数值。
【实验数据处理及结果分析】
如果读取吸光度值A，则按下式计算结果。
【注意事项】
（1）总胆固醇浓度可达12.93mmol/L。若样品中胆固醇含量过高，则可用生理盐水稀释样品，重新测定。结果乘以稀释倍数。
（2）若检测总胆固醇的血清（浆）标本密闭保存，在40℃时可稳定1周，－20℃时可稳定半年以上。
（3）要求空腹抽血测定。
（4）酶分析法测定胆固醇的前两步反应特异性高，而指示反应（第三步反应）特异性则较差，干扰反应往往发生在指示反应中。溶血标本、黄疸标本及高血脂标本均不影响测定结果，但血液中一些还原性物质，如维生素C、谷胱甘肽及左旋多巴可与色原性氧受体竞争H2O2，使结果出现偏差。
（5）试剂中酶的质量影响测定结果。
【实验意义】
1.正常值
正常血清胆固醇浓度为3.6～5.17mmol/L（或参考试剂盒提供的参考范围）。
2.意义
胆固醇是C3位置结合有羟基的类固醇。很多组织均可合成胆固醇，尤其是肝脏或小肠壁。体内约3/4的胆固醇均为合成的，只有1/4来源于饮食。
影响总胆固醇水平的因素如下。①年龄与性别：胆固醇水平往往随年龄上升，但到70岁后有所下降。中青年期女性低于男性，但女性绝经后超过男性。②长期的高胆固醇、高饱和脂肪、长期的高蛋白和高热量饮食，都可使胆固醇水平增高。③遗传因素。④其他，如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可能使胆固醇水平升高。
（1）总胆固醇水平增高常见于以下情况：①甲状腺功能减退、动脉硬化、冠状动脉粥样硬化、心脏病及原发性高脂血症（如家族性高胆固醇血症及高脂血症）、家族性apoB缺陷症、多源性高胆固醇血症、混合性高脂蛋白血症等。②糖尿病：特别是并发糖尿病昏迷时，几乎都有总胆固醇水平升高。③慢性肾炎肾病期、肾病综合征、类脂性肾病等。④胆总管阻塞时，总胆固醇水平增高且伴有黄疸。⑤长期高脂饮食、精神紧张或女性妊娠期，总胆固醇水平也可升高。⑥家族性高总胆固醇血症（低密度脂蛋白受体缺乏），家族性载脂蛋白β缺乏症、混合性高脂蛋白血症。⑦肥大性骨关节炎。⑧老年性白内障、牛皮癣和黏液性水肿等。
（2）总胆固醇水平降低：在低脂蛋白血症、恶性贫血、败血症、溶血性贫血以及甲状腺功能亢进时，血清胆固醇含量降低。其他如感染、营养不良、肠道吸收不良、家族性无β－脂蛋白、低β－脂蛋白血症、药物治疗过程中的溶血性黄疸、慢性消耗性疾病、癌症晚期等情况，胆固醇总量常见降低。近年来大量文献报道表明，血清胆固醇含量过高与动脉粥样硬化的发病机制有关，这更引起了人们的注意。肝脏是胆固醇及胆固醇卵磷脂酰基转移酶（LCAT）合成的器官。严重肝病患者，血清总胆固醇不一定很低，但由于血清中LCAT活力低下，血清胆固醇酯占TC的比例可达50%以下。此外，低总胆固醇者容易发生脑出血，也可能易患癌症（未证实）。
能力检测
一、单项选择题
1.血清总胆固醇水平增高常见于（ ）。
A.肝硬化 B.心肌炎 C.甲状腺功能亢进
D.糖尿病 E.营养不良
2.下列哪种疾病可能不会继发血清总胆固醇水平降低？（ ）
A.低脂蛋白血症 B.恶性贫血 C.败血症
D.溶血性贫血 E.胆总管阻塞
3.Ⅱa型高脂蛋白血症的血清学检查特点是（ ）。
A.血清透明，胆固醇明显增加，甘油三酯正常
B.血清乳白色，胆固醇正常或稍高，甘油三酯明显增加
C.血清混浊，胆固醇稍高，甘油三酯增高
D.血清混浊，胆固醇正常，甘油三酯稍高
E.血清透明，胆固醇增加，甘油三酯低于正常水平
4.以下哪项增高与冠心病发病呈负相关？（ ）
A.HDL－c B.LDL－c C.CHO D.TG E.α－LP
5.血清中的胆固醇在下列哪种脂蛋白中含量最多？（ ）
A.CM B.VLDL C.LDL D.HDL E.α－LP
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